[发明专利]一种用青蒿生产乳铁蛋白的方法

权利要求书

1.一种用青蒿生产乳铁蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)改造载体T202；改造后的载体T202序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)构建青蒿细胞中表达改造后的乳铁蛋白基因的重组质粒T202-Blf；重组质粒T202-Blf的序列如SEQ ID NO.2所示；

(3)用重组质粒T202-Blf转化青蒿；

(4)筛选阳性转基因青蒿植株，获得生产乳铁蛋白的青蒿植株。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述改造载体T202的过程如下：

(a)以pCambia1300为模板，用如下引物对TDNA的pRB序列进行PCR扩增：

引物pRB-F1:5’-GAATTCACTGGGAATTCCCTGGCGTTA-3’；

引物pRB-R1:5’-GGTACCCAGCCTGTCGGGTACCTTAGGA-3’；

(b)将PCR扩增得到的pRB序列测序鉴定；将正确的pRB序列连接到pCambia1301上，得到载体pC13001T，载体pC13001T序列如SEQ ID NO.3所示；

(c)用KpnI和SmaI酶切Actin启动子，同时用KpnI和PmacI酶切载体pC13001T，将酶切的载体pC13001T与酶切的Actin启动子进行连接，构建成改造后的载体T202。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述构建青蒿细胞中表达乳铁蛋白基因的重组质粒T202-Blf的过程如下：

(a)合成改造后的乳铁蛋白基因序列，并将其保存于PMD19Simple质粒中，改造后的乳铁蛋白基因序列如SEQ ID NO.4所示；

(b)用如下引物对保存于PMD19Simple质粒中的改造后的乳铁蛋白基因进行扩增：

引物Blf F1：5’CTGCAGTGGCATCTCTCAGCACATATG 3’；

引物Blf R1：5’TCTAGACTTGTCGTCGTCTTAGTAACA C3’；

(c)将PCR扩增得到的改造后的乳铁蛋白基因测序鉴定；将正确的改造后的乳铁蛋白基因与T-载体连接，得到载体Blf-T，载体Blf-T序列如SEQ ID NO.5所示；

(d)用Pst I、Xba I分别酶切改造后的载体T202和载体Blf-T，将酶切的改造后的载体T202和酶切的载体Blf-T连接，构建成重组质粒T202-Blf。