[发明专利]一种用青蒿生产乳铁蛋白的方法

说明书

本发明公开了一种用青蒿生产乳铁蛋白的方法，包括以下步骤：a、改造并获得载体T202 b、改造并扩增乳铁蛋白基因；c、构建青蒿细胞中表达乳铁蛋白基因的重组质粒T202‑Blf；d、用重组质粒T202‑Blf转化农杆菌EHA105细胞；e、筛选阳性农杆菌EHA105菌株，并进行酶切鉴定；f、转化青蒿，获得阳性含乳铁蛋白的青蒿转化植株；g、实时定量PCR(qRT‑PCR)鉴定乳铁蛋白的表达量。本发明采用的青蒿表达系统具有以下优点：根据青蒿的密码子偏好性，对乳铁蛋白基因的核苷酸序列进行了优化，保证了高效和稳定的mRNA转录、快速和准确的翻译以及较高的外源蛋白质积累；植物表达乳铁蛋白成本低、安全、经济效益好；表达的蛋白产品可直接用于添加，无须纯化。

技术领域

本发明涉及生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种用青蒿生产乳铁蛋白的方法。

背景技术

畜牧业的健康有序发展，不仅关乎人民的食品安全，还对经济有着巨大的影响。而动物疫病的发生，严重影响了畜牧的健康和产量，给广大养殖户带来巨大的经济损失。目前，养殖户主要通过在饲料中添加抗生素来达到防治疫病的目的。但是，大量使用抗生素，会严重破坏动物消化系统的微生态平衡，而且会产生耐药性。抗生素在动物体内会有不同程度的残留，进而影响食用者的身体健康。因此，人们开始呼吁全面禁止在动物饲料中添加抗生素。

抗菌肽(Antibacterial peptide，ABP)是动物先天性免疫的重要组成部分，对细菌、真菌、分枝杆菌、螺旋体、披膜病毒等病原微生物，支原体、衣原体、螺旋体以及一些恶性细胞(如肿瘤细胞)和艾滋病病毒都具有杀伤作用。而且抗菌肽分子通过破坏病原微生物的细胞膜结构，引起胞内水溶性物质大量渗出，而最终导致其死亡，因此病原微生物很难对其产生耐药性。抗菌肽具有无免疫原性，具有高效、安全、无残留等优点，能调节免疫作用，不干扰肠道有益菌等特性，是一种最具开发前景的抗生素替代品。

乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)由1939年Sorensen等人在分离乳清蛋白时发现，并且于1960年由Groves于从牛乳中分离得到。牛乳铁蛋白肽(Bovine Lactoferricin，简写为Lfcin B)是牛乳铁蛋白(bLF)N-端(17～41)的25个氨基酸残基，分子量约为3.1kd，是bLF的抗菌活性中心，对bLF抗菌活性起重要作用(Kanget al,1996)，其抑菌效果是bLF的400倍，且在维持胃肠道正常菌群中发挥重要作用。Lfcin B具有耐热、在消化道不易被降解、无抗原性、调节免疫、广谱抗菌、不干扰肠道有益菌等特性。Lfcin B具有良好的抗菌作用，如大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌等，但不影响双歧杆菌等有益细菌，同时还能刺激细胞的生长。因此，在农业、畜牧、医疗等领域有广阔的应用前景。

本公司之前发明了一种用酵母生产乳铁蛋白的方法，改造后的乳铁蛋白抑菌效果更好；且酵母生长速率快，产量高，无需采用甲醇诱导，易于高密度培养；表达的蛋白产品易于分离纯化；具有多种翻译后修饰特性，如多肽折叠、糖基化、甲基化、乙酰化等；遗传背景清楚，易于对表达载体进行操作。但是在将其推广至大规模工业化生产过程时，存在产量不够稳定，容易被杂菌污染等问题，且相对于植物的种植，该种方法的成本和技术要求仍然偏高。

而青蒿(Artemisia carvifolia)为一年生草本，气香特异，味微苦，有清凉感，能够起到良好的保健作用。花蕾期采收，割取地上部分，切碎，晒干后，可直接用作饲料添加。青蒿作为生产乳铁蛋白的植物，还具有粗生易管，生长期短，投资少，收益快等优点。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种用青蒿生产乳铁蛋白的方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述用青蒿生产乳铁蛋白的方法包括如下步骤：

(1)改造载体T202；改造后的载体T202序列如SEQ ID NO.1所示，全长12259bp；