[发明专利]一种新孢子虫病检测试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测新孢子虫病（Neosporiasis）的遗传标记物，其具有SEQIDNO.4所示的序列或其特异性片段。

2.用于扩增权利要求1所述遗传标记物的特异性引物对。

3.根据权利要求2所述的特异性引物对，其核苷酸序列为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示：

上游引物：5’-TAGACGAATGTAAAGAACGCC-3’

下游引物：5’-CAAATAGATGGTCTGTGCTGTC-3’。

4.与权利要求2或3所述的引物配合使用的荧光探针。

5.根据权利要求4所述的荧光探针，其核苷酸序列为SEQIDNO.3所示：

5’-TTATTCCGCCGTGTTTC-3’。

6.一种检测新孢子虫病的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2或3所述的特异性引物对和权利要求4或5所述的荧光探针。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括实时荧光定量PCR反应试剂，阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为新孢子虫病的标准阳性模板，阴性对照品为灭菌去离子水。

8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，采用3D数字PCR方法进行检测，制定标准阳性模板，其15μL反应体系为：

样品DNA2.0μL

2×3DMasterMix7.5μL

10pM上游引物1.0μL

10pM下游引物1.0μL

10pM荧光探针1.0μL

ddH₂O补至15μL。

9.根据权利要求6-8任一所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中的引物、探针3D数字PCR工作程序为：96℃预变性10min；58℃退火-延伸2min，98℃变性30s，40次循环；60℃延伸2min。

10.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，其采用实时荧光定量PCR方法进行检测，优化后的实时荧光定量PCR反应体系为25μL：

样品DNA1.0μL

2×Real-TimePCRMix12.5μL

10pM上游引物1.0μL

10pM下游引物1.0μL

10pM荧光探针1.0μL

荧光校正液0.5μL

ddH₂O补至25μL。

11.根据权利要求6、7及10任一所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒的工作程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃退火-延伸45s，45次循环。

12.根据权利要求2或3所述的特异性引物对和权利要求4或5所述的荧光探针在制备检测新孢子虫病试剂盒中的应用。