[发明专利]一种新孢子虫病检测试剂盒

说明书

发明领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，是涉及一种基于3D数字PCR标量阳性对照建立的新孢子虫病(Real-TimePCR)检测试剂盒，用于不同动物感染新孢子虫病的临床诊断和日常监测。

背景技术

新孢子虫病(Neosporiasis)是1998年新发现的一种原虫病。病原为犬新孢子虫(Neosporacaninum)，寄生于多种哺乳动物有核细胞内，可导致妊娠母畜发生流产、弱产、死胎等，新生仔畜发生运动障碍和神经系统疾病等，牛对该病尤为灵敏。犬是新孢子虫的终末宿主兼中间宿主，牛、马、羊、鹿等家畜及多种野生动物均可以作为其中间宿主，健康动物通过吞食被新孢子虫孢子化卵囊或速殖子污染的水或饲草而发生水平感染，胎儿及仔畜主要通过胎盘而发生垂直感染，垂直感染是该病的主要传播方式。新孢子虫感染后主要寄生于宿主动物的脑、脊髓、神经和内脏等组织中。据报道，该病在世界范围内牛类动物中的感染率为10％～40％，最高达82％；我国新疆、青海、北京、吉林等地也有该病的报道，其感染率为11.8％～25.4％不等。每年由该病导致的繁殖障碍性疾病给畜牧业生产造成了巨大的经济损失。目前，还没有可用于防治该病的有效疫苗和特效药物，准确的检测、监控技术结合患畜淘汰等措施是综合防治该病的关键。

传统的免疫组织化学技术、超微结构检测技术、病原分离技术等方法过程冗长、操作繁琐，不适用于该病的检测。目前，用于检测该病的方法主要有血清学方法检测抗体和分子生物学方法检测病原DNA。血清学方法在虫体感染早期的检测效果欠佳，本研究运用分子生物学方法着力于研制新孢子虫病Real-TimePCR检测试剂盒，用于早期感染和隐性“带虫”阶段的虫体DNA检测，与新孢子虫病rELISA抗体检测试剂盒形成优势互补，为新孢子虫感染全程的临床诊断和日常监测提供科学的技术支撑。

近年研究发现，由NcSRS2基因编码的P₄₃蛋白是最有希望成为新孢子虫病的诊断抗原和免疫疫苗之一。实时荧光定量PCR技术(Real-TimePCR)具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、方便快捷等特点，已被广泛运用于各种病原的定性和定量检测。其中，TaqmanMGB探针3’端能准确结合到DNA双链小沟部，相对于其他探针具有更好的特异性、灵敏性和稳定性。3D数字PCR技术(3DDigitalPCR)是美国ABI公司于2008年新研发的基于单拷贝模板扩增而设计的一项新型绝对定量分析技术，它是通过PCR扩增和收集发生的荧光信号读取阳性反应数，再根据泊松分布计算出阳性模板DNA分子数。结合3D数字PCR技术建立实时荧光定量PCR(Real-TimePCR)检测方法，无需依赖阳性核酸标准品和Real-TimePCR扩增曲线的循环阈值(C_T)即可实现对扩增模板进行绝对定量分析。

发明内容

本发明的目的：为与新孢子虫病rELISA抗体检测试剂盒的检测效果形成优势互补，本发明通过设计检测引物和荧光探针，结合3D数字PCR系统绝对定量分析，通过优化反应体系和循环条件，建立新孢子虫病Real-TimePCR检测方法。并建立一种基于3D数字PCR标量的新孢子虫病Real-TimePCR检测试剂盒，用于新孢子虫病的临床诊断和流行病学监测。

本发明的技术方案如下：为实现上述目的，发明人下载GenBank数据库中已报道的不同国家和地区的新孢子虫NcSRS2基因序列，通过DNAMAN软件分析下载序列的同源性，找出特异性的保守靶序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，将该靶序列作为检测新孢子虫病的遗传标记物。此外，本领域技术人员应当理解，该序列的特异性片段只可作为检测新孢子虫病的遗传标记物。

设计检测引物、荧光探针和获得地方阳性目的基因片段