[发明专利]一种改良的PK-15细胞传代培养方法及其应用

权利要求书

1.一种改良的PK-15细胞传代培养方法，其特征在于，包括以下步骤:

1)将PK-15细胞分装至滚瓶中，添加培养液，直至滚瓶内溶液体积达到滚瓶体积的10％，PK-15细胞在培养液中的浓度为1-5×10⁴个/mL，所述培养液含10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素；

2)加入消泡剂，所述消泡剂在滚瓶中的浓度为0.5-3.0μL/200mL，混匀后于37℃、6r/h转瓶机中培养，至融合状态达到80％以上。

2.根据权利要求1所述的改良的PK-15细胞传代培养方法，其特征在于，所述消泡剂在滚瓶中的浓度为1.5-3.0μL/200mL。

3.根据权利要求1所述的改良的PK-15细胞传代培养方法，其特征在于，所述步骤1)中的PK-15细胞为扩繁的PK-15细胞，所述扩繁的PK-15细胞按照如下方法获得：将在液氮中冻存的PK-15细胞复苏后，用含10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素的DMEM生长液悬浮，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养，形成100％融合状态的细胞单层，用含胰蛋白酶的消化液分散，然后扩大培养，获取所述扩繁的PK-15细胞。

4.根据权利要求3所述的改良的PK-15细胞传代培养方法，其特征在于，所述PK-15细胞复苏的步骤如下：将PK-15细胞于42℃水浴中快速解冻，然后1000rpm离心5min。

5.如权利要求1-4任一项所述的改良的PK-15细胞传代培养方法的应用，其特征在于：

1)取PK-15细胞分装至滚瓶中，添加培养液，直至滚瓶内溶液体积达到滚瓶体积的10％，PK-15细胞在培养液中的浓度为1-5×10⁴个/mL，所述培养液含10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素；

2)加入消泡剂，所述消泡剂在滚瓶中的浓度为0.5-3.0μL/200mL，按滚瓶内培养液体积的5％接种猪圆环病毒2型病毒悬液，混匀后于37℃、6r/h转瓶机培养24h；

3)弃去培养液，用300mMD-氨基葡糖糖溶液处理30min后，弃去液体，加含2wt％胎牛血清的DMEM培养液，继续培养72h，冻融收获病毒液。

6.根据权利要求5所述的改良的PK-15细胞传代培养方法的应用，其特征在于，所述消泡剂在滚瓶中的浓度为1.5-3.0μL/200mL。

7.根据权利要求5所述的改良的PK-15细胞传代培养方法的应用，其特征在于，所述步骤1)中的PK-15细胞为扩繁的PK-15细胞，所述扩繁的PK-15细胞按照如下方法获得：将在液氮中冻存的PK-15细胞复苏后，用含10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素的DMEM生长液悬浮，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养，形成100％融合状态的细胞单层，用含胰蛋白酶的消化液分散，然后扩大培养，获取所述扩繁的PK-15细胞。

8.根据权利要求7所述的改良的PK-15细胞传代培养方法的应用，其特征在于，所述PK-15细胞复苏的步骤如下：将PK-15细胞于42℃水浴中快速解冻，然后1000rpm离心5min。