[发明专利]一种改良的PK-15细胞传代培养方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于细胞培养工程技术领域，具体涉及一种改良的PK-15细胞传代方法及其应用。

背景技术

PK-15细胞由猪肾细胞驯化而来的传代细胞系，可用于多种动物病毒的培养，猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒等。目前，PK-15细胞最大的应用即用于猪圆环病毒2型培养，灭活后制备疫苗。

研究发现，PK-15培养时，尤其大规模培养时，容易聚团，导致细胞生长不均匀，且猪圆环病毒2型培养时大多采用同步方式接种，即将细胞消化分散的细胞分装后直接接种猪圆环病毒2型病毒悬液，然后共同培养，同步接种方式较分步接种产毒量高，更适合于大生产，但同步接种更容易导致细胞聚团，从而影响细胞的生产及病毒的增殖效率。培养操作过程中发现，细胞传代时产生的泡沫是导致细胞聚团的主要原因，尤其利用滚瓶大规模培养细胞时，泡沫粘附于瓶壁，培养时，细胞不断聚集于此，最终成团。

发明内容

本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种能减少细胞聚团，细胞分散均匀,生产效率高的改良的PK-15细胞传代培养方法。

本发明的另一目的在于将上述改良的PK-15细胞传代培养方法应用于猪圆环病毒2型的繁殖中。

本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：

根据本发明所提供的一种改良的PK-15细胞传代培养方法，包括以下步骤:

1)将PK-15细胞分装至滚瓶中，添加培养液，直至滚瓶内溶液体积达到滚瓶体积的10％，PK-15细胞在培养液中的浓度为1-5×10⁴个/mL，所述培养液含10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素；

2)加入消泡剂，所述消泡剂在滚瓶中的浓度为0.5-3.0μL/200mL，混匀后于37℃、6r/h转瓶机中培养，至融合状态达到80％以上。

本发明中，所述步骤1)中的PK-15细胞为扩繁的PK-15细胞，所述扩繁的PK-15细胞按照如下方法获得：将在液氮中冻存的PK-15细胞复苏后，用含10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素的DMEM生长液悬浮，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养，形成100％融合状态的细胞单层，用含胰蛋白酶的消化液分散，然后扩大培养，获取所述扩繁的PK-15细胞。

其中，PK-15细胞复苏的步骤如下：将PK-15细胞于42℃水浴中快速解冻，然后1000rpm离心5min。

本发明中，所述消泡剂购买于Sigma公司，其型号为Antifoam204(A8311)。优选地，所述消泡剂在滚瓶中的浓度为1.5-3.0μL/200mL。

本发明的另一个目的可以通过采取如下技术方案达到：

一种改良的PK-15细胞传代培养方法的应用，包括以下步骤：

1)将PK-15细胞分装至滚瓶中，添加培养液，直至滚瓶内溶液体积达到滚瓶体积的10％，PK-15细胞在培养液中的浓度为1-5×10⁴个/mL，所述培养液含10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素；

2)加入消泡剂，所述消泡剂在滚瓶中的浓度为0.5-3.0μL/200mL；按滚瓶内培养液体积的5％接种猪圆环病毒2型病毒悬液，混匀后于37℃、6r/h转瓶机培养24h；

3)弃去培养液，用300mMD-氨基葡糖糖溶液处理30min后，弃去液体，加含2wt％胎牛血清的DMEM培养液，继续培养72h，冻融收获病毒液。

其中，步骤1)中的PK-15细胞为扩繁的PK-15细胞，所述扩繁的PK-15细胞按照如下方法获得：将在液氮中冻存的PK-15细胞复苏后，用含10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素的DMEM生长液悬浮，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养，形成100％融合状态的细胞单层，用含胰蛋白酶的消化液分散，然后扩大培养，获取所述扩繁的PK-15细胞。

其中，所述PK-15细胞复苏的步骤如下：将PK-15细胞于42℃水浴中快速解冻，然后1000rpm离心5min。

优选地，所述消泡剂在滚瓶中的浓度为1.5-3.0μL/200mL。

本发明所提供的技术方案可以包括以下技术效果：

(1)在PK-15细胞传代培养过程中，加入消泡剂，消泡剂能有效消除细胞传代操作过程中产生的泡沫，使细胞生长状态保持良好，且能有效减少细胞聚团。

(2)采用改良的PK-15细胞传代培养方法培养细胞后，有效消除细胞传代操作过程中产生的泡沫，有利于猪圆环病毒2型(JM株)的增殖。

附图说明