[发明专利]PCNA融合蛋白及表达方法和生物素化方法在审
申请号: | 201510787513.6 | 申请日: | 2015-11-17 |
公开(公告)号: | CN105504064A | 公开(公告)日: | 2016-04-20 |
发明(设计)人: | 毛海燕;钱林;徐梦凯;周延庆;夏波;彭会军;李庆春 | 申请(专利权)人: | 苏州浩欧博生物医药有限公司 |
主分类号: | C07K19/00 | 分类号: | C07K19/00;C12N15/70;C07K1/13 |
代理公司: | 苏州广正知识产权代理有限公司 32234 | 代理人: | 徐萍 |
地址: | 215000 江苏省苏州市工*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | pcna 融合 蛋白 表达 方法 生物素 | ||
1.一种PCNA融合蛋白,其特征在于,所述PCNA融合蛋白的序列为SeqNo.1,所述序列包 括849个碱基,共编码283个氨基酸,所述编码序列中前261个氨基酸为PCNA序列。
2.一种PCNA融合蛋白的表达方法,其特征在于,包括步骤为:
(1)对PCNA基因进行PCR扩增得到PCR产物,上游引物包括BamHI序列,下游引物包括 XhoI序列;
(2)分别对PCR产物和表达载体pET-22b(+)用限制性内切酶进行酶切,酶切后的所述 PCR产物和所述表达载体连接得到连接产物,所述限制性内切酶为BamHI和XhoI;
(3)将所述连接产物转化入E.coliDH5α感受态细胞中,并于培养基上进行培养得到 阳性质粒;
(4)将所述阳性质粒转入E.coliBL21感受态细胞中,并于培养基上培养得到阳性菌 种,并对所述阳性菌种进行诱导培养;
(5)对所述诱导培养后的阳性菌种纯化,得到PCNA融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的PCNA融合蛋白的表达方法,其特征在于,步骤(1)中所述上游 引物为5'-CGGATCCGATGTTCGAGGCGC-3',所述下游引物为5'-CTCGAGAGAGCCTTAGTGCCA-3'。
4.根据权利要求2所述的PCNA融合蛋白的表达方法,其特征在于,步骤(3)中所述连接 产物转化入细胞中是通过热激法实现的;步骤(3)中所述细胞涂布于含40μg/mL氨苄青霉素 的LB固体琼脂培养基上,挑取单菌落接种至含有40μg/mL氨苄青霉素的LB液体琼脂培养基 中培养;步骤(3)中所述培养过夜,提取质粒后进行双酶切,鉴定并筛选得到阳性质粒。
5.根据权利要求2所述的PCNA融合蛋白的表达方法,其特征在于,步骤(4)中所述阳性 质粒转入细胞中是通过热激法实现的;步骤(4)中所述细胞涂布于含40μg/mL氨苄青霉素的 LB固体琼脂培养基上,在37℃下培养16小时,挑取单菌落接种至含有40μg/mL氨苄青霉素的 LB液体琼脂培养基中培养;步骤(4)中所述培养为过夜培养,培养后提取质粒,双酶切,筛选 得到阳性菌种。
6.根据权利要求2所述的PCNA融合蛋白的表达方法,其特征在于,步骤(4)中对所述阳 性菌种进行诱导培养的步骤为:将所述阳性菌种转接至含有40μg/mL氨苄青霉素的LB液体 琼脂培养基中培养,并加入IPTG进行诱导表达优化,诱导培养温度为20-37℃。
7.根据权利要求2所述的PCNA融合蛋白的表达方法,其特征在于,步骤(5)中所述诱导 培养后的阳性菌种先进行离心并超声破碎,再用BindingBuffer平衡好的Ni-NTAAgarose 亲和层析柱纯化。
8.一种PCNA融合蛋白的生物素化方法,其特征在于,包括步骤为:向N,N-二羟乙基甘氨 酸溶液中加入PCNA融合蛋白、生物素连接酶、三磷酸腺苷、乙酸镁和生物素混匀孵育,去除 游离生物素得到生物素化的PCNA融合蛋白。
9.根据权利要求8所述的PCNA融合蛋白的生物素化方法,其特征在于,所述孵育是在30 ℃下孵育1小时,所述去除游离生物素是在超滤管中进行的。
10.根据权利要求8所述的PCNA融合蛋白的生物素化方法,其特征在于,所述生物素化 的PCNA融合蛋白是包被于ELISA板上,通过Streptavidin-HRP二抗进行检测判断。
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