[发明专利]PCNA融合蛋白及表达方法和生物素化方法

说明书

技术领域

本发明涉及医药生物领域，特别是涉及一种PCNA融合蛋白及表达方法和生物素化 方法。

背景技术

1978年，Miyachi等在系统性红斑狼疮患者的血清中发现了一种只存在于增殖性 细胞（正常增殖细胞及肿瘤细胞）的抗原，并将其命名为增殖细胞核抗原（Proliferating CellNuclearAntigen，简称PCNA）。以后的研究发现PCNA与细胞增殖的启动密切相关，是 反映细胞增殖状态的良好指标，因此近年来掀起了对PCNA研究的热潮，尤其在肿瘤方面。

PCNA作为细胞异常增殖的关键蛋白与临床研究紧密相关。国内外在多种肿瘤疾病 中进行了PCNA的研究，涉及PCNA与肿瘤发生发展、分级、分期、放疗敏感性、预后、复发和转 移、死亡原因、肿瘤标志物等各个方面的相关性。研究结果显示：在常见的胃癌、肺癌、肝癌 等疾病中都有PCNA的异常表达。除此之外，也有研究表明某些细胞增殖性疾病的发生和发 展也与PCNA相关，如：类风湿性关节炎中滑膜细胞、老年核性白内障和皮质性白内障晶体上 皮细胞及动脉粥样硬化中血管平滑肌细胞的异常增殖。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种PCNA融合蛋白及表达方法和生物素化方 法，该融合蛋白涵盖了人PCNA的主要抗原表位，采用BirA活化生物素形成生物素酰-5'-腺 苷酸，将生物素特异地转移到PCNA-Avitag上，反应条件温和且标记的专一性极高。每一个 AviTag仅可以加入一个生物素分子，对整个蛋白的活性和功能影响很小，因此本方法特别 适合用于抗原的生物素化。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种PCNA融合蛋白，所 述PCNA融合蛋白的序列为SeqNo.1，所述序列包括849个碱基，共编码283个氨基酸，所述编 码序列中前261个氨基酸为PCNA序列。

提供一种PCNA融合蛋白的表达方法，包括步骤为：

（1）对PCNA基因进行PCR扩增得到PCR产物，上游引物包括BamHI序列，下游引物包括 XhoI序列；

（2）分别对PCR产物和表达载体pET-22b(+)用限制性内切酶进行酶切，酶切后的所述 PCR产物和所述表达载体连接得到连接产物，所述限制性内切酶为BamHI和XhoI；

（3）将所述连接产物转化入E.coliDH5α感受态细胞中，并于培养基上进行培养得到 阳性质粒；

（4）将所述阳性质粒转入E.coliBL21感受态细胞中，并于培养基上培养得到阳性菌 种，并对所述阳性菌种进行诱导培养；

（5）对所述诱导培养后的阳性菌种纯化，得到PCNA融合蛋白。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中所述上游引物为5'- CGGATCCGATGTTCGAGGCGC-3'，所述下游引物为5'-CTCGAGAGAGCCTTAGTGCCA-3'。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（3）中所述连接产物转化入细胞中是通过热激 法实现的；步骤（3）中所述细胞涂布于含40μg/mL氨苄青霉素的LB固体琼脂培养基上，挑取 单菌落接种至含有40μg/mL氨苄青霉素的LB液体琼脂培养基中培养；步骤（3）中所述培养过 夜，提取质粒后进行双酶切，鉴定并筛选得到阳性质粒。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（4）中所述阳性质粒转入细胞中是通过热激法 实现的；步骤（4）中所述细胞涂布于含40μg/mL氨苄青霉素的LB固体琼脂培养基上，在37℃ 下培养16小时，挑取单菌落接种至含有40μg/mL氨苄青霉素的LB液体琼脂培养基中培养；步 骤（4）中所述培养为过夜培养，培养后提取质粒，双酶切，筛选得到阳性菌种。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（4）中对所述阳性菌种进行诱导培养的步骤为： 将所述阳性菌种转接至含有40μg/mL氨苄青霉素的LB液体琼脂培养基中培养，并加入IPTG 进行诱导表达优化，诱导培养温度为20-37℃。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（5）中所述诱导培养后的阳性菌种先进行离心 并超声破碎，再用BindingBuffer平衡好的Ni-NTAAgarose亲和层析柱纯化。

提供一种PCNA融合蛋白的生物素化方法，包括步骤为：向N,N-二羟乙基甘氨酸溶 液中加入PCNA融合蛋白、生物素连接酶、三磷酸腺苷、乙酸镁和生物素混匀孵育，去除游离 生物素得到生物素化的PCNA融合蛋白。