[发明专利]全自动测定抗蛋白酶3抗体IgG的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及磁微粒化学发光免疫诊断技术领域，特别是涉及一种全自动测定抗蛋白酶3抗体IgG的试剂盒及方法。

背景技术

蛋白酶3（Proteinase3，PR3）是中性粒细胞胞浆嗜天青颗粒中的一种丝氨酸蛋白酶，分子量约为29KDa的糖蛋白。PR3能降解多种细胞外基质如弹性蛋白、血红蛋白、IV型胶原等多种组织成分。此外，蛋白酶3通过组织蛋白酶G促进血小板活化，并使C1抑制剂失活。

ANCA产生的荧光模式包括胞浆型（cANCA）、核周型（pANCA)。抗中性粒细胞胞质抗体（antineutrophilcytoplasmicantibodies.ANCA）是目前用于诊断原发性小血管炎最重要的血清学检测指标，蛋白酶3是cANCA的主要靶抗原在间接免疫荧光法检测用乙醇固定的中性粒细胞呈cANCA荧光模式，约占C-ANCA的80％～90％。

韦格纳肉芽肿(Wegener′sgranulomatosis，WG)是一种特殊类型的坏死性肉芽肿性血管炎。其临床的复杂性和诊治的困难性一直是困扰风湿病专科医师的问题。WG的诊断主要依据临床症状，而临床表现复杂多样、因人而异。抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)是对WG最有诊断意义的自身抗体。

过去WG的诊断主要是根据典型的临床表现和病史，但有些患者，尤其是限局性的患者很难诊断，病检是确诊WG的重要手段。但一次或单部位病检阴性并不能排除WG。目前的研究认为大部分WG患者的ANCA特异性靶抗原是PR3，抗PR3抗体与WG的诊断和疾病活动密切相关。胞浆型ANCA(cytoplasmicANCA，cANCA)和抗PR3抗体对WG诊断意义有高度的敏感性和特异性。国外报道在活检证实为WG的患者中，抗PR3抗体特异性为90％以上。敏感性是与疾病的活动性有关。通常抗PR3抗体滴度与疾病活动一致，活动性WG患者在病变尚未影响到呼吸系统时抗PR3抗体敏感性是65%，当患者出现呼吸系统、肾脏损害时其灵敏度达90%以上。活动期滴度较高，部分缓解期滴度很低，完全缓解的患者多数测不到。缓解期抗PR3抗体滴度的升高可能预示着复发，并且有助于将感染和复发区分开。

对于此病的检测方法主要为间接免疫荧光法和酶联免疫吸附法，但这些方法都存在着不足之处。

一、间接免疫荧光法：该法的基本原理是用特异性的抗体与切片中的抗原结合后，继用间接荧光抗体，与前面的抗原抗体复合物结合，形成抗原抗体荧光复合物。在荧光显微镜下，根据复合物的发光情况来确定所检测的抗原。该方法评价：由于结合在抗原抗体复合物上的荧光素抗体增多，发出的荧光亮度强，因而其敏感性强。但是其不足也是明显的：

（1）运用此法可能出现假阳性。

（2）在分析结果时无法根据分子量的大小区分非特异性识别。

（3）操作相对复杂，需要价格较昂贵的荧光显微镜，在很多基层医院难以推广，也不太适用于标本量较多的实验室。

（4）荧光测定中的本底较高，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。

（5）结果判定需要有经验的专业人员，分析结果的客观性不足。

二、酶联免疫吸附法：ELISA检测抗PR3抗体，简便易行，特异性高，与间接免疫荧光法联合检测，可为临床对WG的诊断和治疗提供更为客观的实验依据。但与其他生物检测或免疫检测比较，这种ELISA检测方法、技术、工具或产品仍有较多的不足而使其应用受限，这些不足主要包括以下几个方面：

（1）检测试剂在检测过程中为开放方式，容易引起各种试剂之间的交叉污染而影响检测结果；

（2）ELISA方法多采用辣根过氧化物酶进行检测，其检测范围和灵敏度都较低。

（3）ELISA方法的检测时间通常反应是一件较长，完成一个测试所需的总时间一般在2个小时以上，不能完全满足临床上的快速诊断的需求。

（4）通常ELISA方法所用的试剂较多，通常在11种试剂左右，在临床检查过程中，极易出现试剂混用造成结果判读无效的情况。

通常测定蛋白酶3抗体IgG的方法为酶联免疫分析法，此方法采用的是辣根过氧化物酶系统，将待测样品中的待测抗蛋白酶3抗体IgG与高度纯化的人蛋白酶3抗原进行反应而形成第一免疫络合物，该第一免疫络合物与酶标记的第二抗体进行反应形成第二免疫络合物，将反应形成的第二络合物与显色底物进行显色对比分析，从而获得待测抗蛋白酶3抗体IgG的含量。本方法采用的辣根过氧化物酶的灵敏度相比某些酶的灵敏度低10倍左右，而且酶联免疫检测方法的反应时间较长，通常完成一个测试大概在2个小时左右。实验中操作比较繁琐。

发明内容