[发明专利]一种异香豆素类化合物及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种异香豆素类化合物，其特征在于所述的异香豆素类化合物是以百合科植物滇重楼(Parispolyphyllavar.yunnanensis)中得到的曲霉属真菌米曲霉(Aspergillusoryzae)的固体发酵物为原料，经有机溶剂提取、正反相硅胶柱层析富集、高压液相色谱分离获得，其分子式为C₁₅H₁₆O₅，命名为米曲霉素A，英文名为oryzaeinsA，其结构式为：

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2.一种权利要求1所述的异香豆素类化合物的制备方法，其特征在于是以百合科植物滇重楼(Parispolyphyllavar.yunnanensis)中得到的曲霉属真菌米曲霉(Aspergillusoryzae)的固体发酵物为原料，经有机溶剂提取、正反相硅胶柱层析富集、高压液相色谱分离获得，具体为：

A、内生真菌米曲霉(Aspergillusoryzae)的分离：将75%乙醇消毒后的百合科重楼属滇重楼(Parispolyphyllavar.yunnanensis)茎秆和/或叶片放入无菌的研钵中进行研磨，研磨后转入无菌的塑料管内，1000~3000rpm离心2~10min，吸取1~100微升上清液，涂布在BL平板上，倒置于培养箱中，25~30摄氏度黑暗培养2~10天，反复挑取单菌落培养并编号保存菌种，直到获得单一内生真菌菌落，经ITS测序确定为曲霉属真菌米曲霉(Aspergillusoryzae)；

B、内生真菌米曲霉(Aspergillusoryzae)菌种培养：A步骤分离得到的米曲霉菌种在室温下接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25~30℃培养7~10天，再接种在50~500毫升的三角瓶中，每个三角瓶含10~100毫升马铃薯葡萄糖培养基，置于25~30摄氏度下震荡培养5~10天得到液体发酵种子；

C、米曲霉(Aspergillusoryzae)的规模化发酵：将B步骤培养得到的的液体发酵种子进行规模化发酵，规模化发酵是在100~1000个100~500ml的冯巴赫瓶中进行，每个瓶含有10~200g大米和10~200ml蒸馏水，每个瓶中接种1.0~5.0ml步骤B培养得到的液体发酵种子，于25~30℃培养15~45天得到米曲霉发酵物；

D、浸膏提取：将C步骤发酵得到的米曲霉发酵物用有机溶剂超声提取2~5次，每次30~60min，合并提取液后过滤提取液，减压浓缩，静置，滤除沉淀物，浓缩得到浸膏a；

E、硅胶柱层析：将D步骤所得的浸膏a用浸膏a重量的1.5~3倍量的丙酮或者二氯甲烷溶解，用浸膏a重量的1~1.5倍量的80~100目硅胶拌样，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为200~300目，用量为浸膏a重量的6~10倍量；用体积配比为20:1~0:1的混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC或分析型HPLC监测，合并相同的部分；

F、反相柱层析：将E步骤中以8:2配比的混合有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液上反相柱层析，反相柱是用反相材料C-18装柱；用体积浓度为20~80%的甲醇溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分。

G、高效液相色谱分离：将以体积浓度50~70%甲醇溶液洗脱得到的洗脱液经高效液相色谱分离纯化，即得所述的异香豆素类化合物米曲霉素A，英文名为oryzaeinsA。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于A步骤中所述的研磨是将75%乙醇消毒后的百合科重楼属滇重楼(Parispolyphyllavar.yunnanensis)茎秆和叶片放入无菌的研钵中，加入茎秆和/或叶片总重量0.5~1.0倍的水、再加入茎秆和/或叶片总重量1.0~2.0倍的石英砂进行研磨。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于D步骤中所述的有机溶剂为体积百分浓度70~100%的丙酮、体积百分浓度90~100%的乙醇、体积百分浓度90~100%的乙酸乙酯或体积百分浓度90~100%的甲醇。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于E步骤所述的混合有机溶剂为氯仿-甲醇、石油醚-乙酸乙酯、氯仿-丙酮、石油醚-丙酮或环己烷-异丙醇。