[发明专利]一种高效表达中华绒螯蟹抗脂多糖因子的酿酒酵母工程菌

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效表达中华绒螯蟹抗脂多糖因子的酿酒酵母工程菌，属于生物技术领域。

背景技术

水产养殖业是我国经济出口创汇的重要产业之一，渔业在我国已成为农业经济的增长点。近年来甲壳类动物病害日趋严重，给我国水产养殖业带来巨大的经济损失。

甲壳类动物缺乏后天获得的特异性免疫功能，但是它们有比较完善的先天性非特异性免疫系统，能够迅速识别和有效清除入侵的微生物。甲壳类动物的非特异性免疫机制包括甲壳和粘液的屏障作用、网状内皮系统的吞噬作用以及非特异性体液分子。(1)模式识别蛋白(Patternrecognitionproteins,PRPs)，包括LGBP(lipopolysaccharideandβ-1,3-glucan-bindingprotein,LGBP)与抗脂多糖因子(Anti-Lipopolysaccharidefactor，ALF)等，它们能与外来病原表面的脂多糖β-1,3-葡聚糖和肽聚糖等结合并等识别病原体相关的分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs)，继而激活酚氧化酶原(pro-phenoloxidase，proPO)系统；(2)酚氧化酶激活系统。甲壳动物酚氧化酶酶原在血细胞中合成后释放到血浆中。酚氧化酶酶原通过酚氧化酶酶原激活酶的水解转化成有活性的酚氧化酶，催化单酚化合物氧化成邻二酚产物(o-diphenols)，再氧化成邻二醌(o-quinones)，邻二醌抑制病原体胞外蛋白酶和几丁质酶的活性，从而抑制甚至杀死病原体。

目前，中华绒螯蟹ALF基因的EST序列被测定，ALF全长的基因也被克隆(Li，2008)。有研究学者将中华绒螯蟹ALF基因在大肠杆菌中进行原核表达，但大肠杆菌表达体系常会导致蛋白聚集形成不溶的无活性的包涵体，复性过程繁琐，产出率低等因素大大提高工业生产的成本，且蛋白表达量不高。目前也没有中华绒螯蟹ALF在真核宿主中的表达。众所周知，基因的异源表达受到宿主、载体、启动元件等多种因素的影响。因此，如何实现甲壳类动物来源的ALF的异源表达、活性表达、高效表达是目前亟需解决的问题。

发明内容

为了克服上述问题，本发明利用酿酒酵母构建真核表达载体，实现了中华绒螯蟹重要免疫因子ALF进行高效活性表达。本发明构建的酿酒酵母真核表达工程菌株必将在水产养殖上发挥重要作用。

本发明的第一个目的是提供一种高效表达中华绒螯蟹抗脂多糖因子的酿酒酵母工程菌，所述基因工程菌的构建方法是将中华绒螯蟹抗脂多糖因子EsALF的cDNA克隆至表达质粒pHAC181上得到测序验证正确的重组质粒pHAC181-EsALF，然后设计同源重组引物，利用同源重组技术将目的基因EsALF整合至酿酒酵母宿主菌株的GAL1启动子下游。该工程菌在半乳糖的诱导下，可高效表达目的蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述EsALF的cDNA的CDS(codingsequence)区域翻译后的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述EsALF的cDNA的CDS区域的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述表达质粒pHAC181是在商业化质粒YCplac181的SphI和EcoRV位点插入3个组氨酸标签得到的，详见文献：AnalysesoftheeffectsofRck2pmutantsonPbs2p^DD-inducedtoxicityinSaccharomycescervisiaeidentifyaMAPkinasedockingmotif,andunexpectedfunctionalinactivationduetoacidicsubstitutionofT379,MolGenGenomics,2004,271:208–219.

在本发明的一种实施方式中，所述宿主菌株为酿酒酵母GAL1-ScRCH1，是将酿酒酵母BY4741(Sc04153268_s1)菌株里的ScRCH1基因的启动子替换成GAL1启动子。