[发明专利]牛PSMA5基因RNA干扰载体的构建与筛选及在奶牛乳腺上皮细胞中的表达

权利要求书

1.牛PSMA5基因RNA干扰载体的构建与筛选及在奶牛乳腺上皮细胞中的 表达，其特征在于，包括如下步骤：

S1、在NCBI上查询牛PSMA5基因的CDS区序列，根据shRNA的设计原则在 invitrogen的shRNA在线设计网站上设计PSMA5基因的shRNA靶序列；

S2、选择4条合适的shRNA靶序列以及一条阴性对照序列，根据 pLVX-shRNA2-puro质粒的酶切位点以及shRNA的设计原则在选择的shRNA靶序 列上加上酶切位点、茎环结构和终止转录的序列，送到华大基因合成；

S3、将正义链(100uM)5ul；反义链(100uM)5ul；10X退火缓冲液5ul； ddH2035ul混合后置于水浴锅中，95℃加热5min后，关闭水浴锅自然降温 至30℃以下，取样电泳，切胶回收退火产物，置于-20℃备用；

S4、用EcoRl、BamHl限制性内切酶双酶切pLVX-shRNA2-puro空质粒，37℃， 4h，酶切体系如下：pLVX-shRNA2-puro空质粒20ul；EcoRl限制性内切酶1 ul；BamHl限制性内切酶1ul；10XCutSmart缓冲液5ul；ddH2023ul；

S5、将所得退火产物与所得的双酶切的pLVX-shRNA2-puro空质粒用T4DNA 连接酶连接，16℃，过夜；

S6、将测序正确的菌液进行无内毒素质粒大提，提取的质粒以备转染细胞； 将MAC-T细胞培养到汇合度为80％时，传代到6孔板中，24h后进行细胞转染， 按照lipofectamine^TM2000说明操作，转染48h后检测荧光；

S7、收集转染后48h的细胞，提取RNA，-80℃备用，筛选出最有效的shRNA 重新转染细胞，待细胞汇合度大于90％后，更换分化培养基；分化培养4days 后提取RNA和总蛋白，-80℃备用；

S8、在NBCI上找到牛的内参基因β-actin和PSMA5的CDS区序列，用primer premier5软件设计引物，送华大基因合成，引物序列如下：

β-actin-F：5’CAGCAAGCAGGAGTACGATG3’；

β-actin-R：5’AGCCATGCCAATCTCATCTC3’；

PSMA5-F：5’CCTTCGGAGTAGCACTGTTAT3’；

PSMA5-R：5’CTCTGAGCACCCTCTGAAGC3’；

反应体系如下：2XFastStartUniversalSYBRGreenMaster(Rox)10 ul；引物(上)0.4ul；引物(下)0.4ul；模板cDNA1ul；ddH208.2ul；

S9、按照如下程序进行实时荧光定量PCR：条件如下

首先在95℃运行2min，之后40个PCR循环(95℃10s；60℃34s)；之后95℃ 1min；55℃30s；95℃30s；

S10、采用2^-ΔΔct法计算荧光定量结果，在4条设计的shRNA序列中选取 干扰效率最高的一条，再转染细胞，进行后续的Westernblotting检测。

2.根据权利要求1所述的牛PSMA5基因RNA干扰载体的构建与筛选及在 奶牛乳腺上皮细胞中的表达，其特征在于，所述步骤S5中的连接体系如下： 退火产物1ul；pLVX-shRNA2-puro双酶切产物1ul；T4DNA连接酶1ul； 10XT4DNA连接酶缓冲液1ul；ddH206ul。

3.根据权利要求1所述的牛PSMA5基因RNA干扰载体的构建与筛选及在 奶牛乳腺上皮细胞中的表达，其特征在于，所述Westernblotting检测包括 如下步骤：首先将总蛋白用BCA试剂盒进行浓度测定，按每孔10ug的量上样， 电泳时间为70v，3小时；120v，2小时；采用半干转方法，15v，45min， 将目的蛋白转印到硝酸纤维素膜(NC)上；采用5％脱脂奶粉封闭3h，一抗4℃ 过夜孵育；然后用TBST洗三次，每次15分钟；再孵育二抗，室温3小时；最 后用ECL发光液显影，用TanonGis软件进行灰度值分析。