[发明专利]牛PSMA5基因RNA干扰载体的构建与筛选及在奶牛乳腺上皮细胞中的表达

说明书

技术领域

本发明涉及基因生物领域，具体涉及一种牛PSMA5基因RNA干扰载体的构 建与筛选及在奶牛乳腺上皮细胞中的表达。

背景技术

PSMA5基因具有多种生物学功能，它是26s蛋白酶体的组成元件，26s蛋 白酶体负责细胞大多数蛋白质的降解，它是生物体内的重要降解途径，关系到 很多生物进程。在之前的蛋白组学研究中发现，PSMA5在乳腺的共轭亚油酸 (CLA)内源性合成中表达上调，因此推测PSMA5可能参与CLA的内源性合成。

CLA是亚油酸的同分异构体，是一系列含有碳8、9、10、11开始的共轭 双键，具有位置和几何异构的十八碳二烯酸的异构体的总称。CLA是近几十年 来，在反刍动物中发现的一种对人体有益的功能性不饱和脂肪酸。它具有令人 瞩目的生理活性，如抗癌、抗动脉硬化症、抗糖尿病、提高免疫力、改善骨组 织代谢、抑制脂肪沉积等生物学功能。因此，如何提高CLA合成的含量成为近 几十年来国内外的一个研究热点。在自然界CLA主要以cis-9，trans-11CLA 的形式存在于反刍动物的乳制品和肉制品中。前期的研究可知牛奶中CLA主要 通过乳腺中内源性合成而来，但是其合成机制还不明确。目前的研究仅仅知道 TVA可以通过硬脂酰辅酶A去饱和酶SCD的去饱和作用转化成CLA，但除了SCD 以外还可能存在其他的蛋白参与并调控CLA的合成。尽管以现有的营养调控手 段可以提高牛奶中CLA的含量，但是其含量还远不能发挥CLA的最佳生理功效。 因此只有对乳腺中CLA合成的调控机制进行深入的研究，明确乳腺中内源性合 成CLA的机制，才能利用分子营养学手段来进一步提高乳中CLA的含量。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了牛PSMA5基因RNA干扰载体的构建与筛选 及在奶牛乳腺上皮细胞中的表达。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

牛PSMA5基因RNA干扰载体的构建与筛选及在奶牛乳腺上皮细胞中的表 达，包括如下步骤：

S1、在NCBI上查询牛PSMA5基因的CDS区序列，根据shRNA的设计原则在 invitrogen的shRNA在线设计网站上设计PSMA5基因的shRNA靶序列；

S2、选择4条合适的shRNA靶序列以及一条阴性对照序列，根据 pLVX-shRNA2-puro质粒的酶切位点以及shRNA的设计原则在选择的shRNA靶序 列上加上酶切位点、茎环结构和终止转录的序列，送到华大基因合成；

S3、将正义链(100uM)5ul；反义链(100uM)5ul；10X退火缓冲液5 ul；ddH2035ul混合后置于水浴锅中，95℃加热5min后，关闭水浴锅自然 降温至30℃以下，取样电泳，切胶回收退火产物，置于-20℃备用；

S4、用EcoRI、BamHI限制性内切酶双酶切pLVX-shRNA2-puro空质粒，37℃， 4h，酶切体系如下：pLVX-shRNA2-puro空质粒20ul；EcoRI限制性内切酶1 ul；BamHI限制性内切酶1ul；10XCutSmart缓冲液5ul；ddH2023ul；

S5、将所得退火产物与所得的双酶切的pLVX-shRNA2-puro空质粒用T4DNA 连接酶连接，16℃，过夜；

S6、将测序正确的菌液进行无内毒素质粒大提，提取的质粒以备转染细胞； 将MAC-T细胞培养到汇合度为80％时，传代到6孔板中，24h后进行细胞转染， 按照lipofectamine^TM2000说明操作，转染48h后检测荧光；

S7、收集转染后48h的细胞，提取RNA，-80℃备用，筛选出最有效的shRNA 重新转染细胞，待细胞汇合度大于90％后，更换分化培养基；分化培养4days 后提取RNA和总蛋白，-80℃备用；

S8、在NBCI上找到牛的内参基因β-actin和PSMA5的CDS区序列，用primer premier5软件设计引物，送华大基因合成，引物序列如下：

β-actin-F：5’CAGCAAGCAGGAGTACGATG3’；

β-actin-R：5’AGCCATGCCAATCTCATCTC3’；

PSMA5-F：5’CCTTCGGAGTAGCACTGTTAT3’；

PSMA5-R：5’CTCTGAGCACCCTCTGAAGC3’；