[发明专利]一种防治苹果树腐烂病的生防菌发酵液的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及苹果树腐烂病的防治领域，具体涉及一种防治苹果树腐烂病的生防菌发酵液的制备方法。

背景技术

苹果树腐烂病是我国苹果产区危害较严重的病害之一。该病引起苹果树树皮腐烂、树势衰弱、苹果产量和品质下降；严重时引起主杆以致整树枯死，甚至造成毁园。当前，腐烂病严重制约着苹果产业的发展。农业部苹果现代产业技术体系调查表明：苹果树腐烂病总体发病率达52.7％。随着树龄的增大，腐烂病发病株率提高，4-10年生果树株发病率为26.8％，11-17年树龄的果树株发病率为54.0％，18-24年生果树株发病率为59.3％。当前，生产上主要使用化学药剂防治苹果树腐烂病病。然而，长期大量使用化学药剂不仅使果园生态环境恶化并给食品安全带来极大隐患，而且容易导致腐烂病菌抗药性菌株的出现。尽管化学药剂在农业生产仍占主导地位，但寻求对环境友好且高效的防治方法已成为亟待解决的问题。

生物防治技术作为一种安全有效的防治措施越来越受到人们的关注。国内外学者先后报道哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、深绿木霉(Trichodermaatroviride)、螺旋毛壳(Chaetomiumspirale)、内生放线菌、链霉菌等对苹果树腐烂病菌具有拮抗作用。目前，应用较多的生防细菌主要有芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞杆菌(Pseudomonas)、土壤放射杆菌(Agrobacteriumradiobacter)等。其中，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一种革兰氏阳性杆状细菌；其抑菌范围很广(包括番茄叶病、枯萎病、黄瓜枯萎病、霜霉病、灰霉病、白粉病、腐烂病等)，是一种理想的生防微生物。枯草芽孢杆菌杀菌剂具有对人畜相对安全、环境兼容性好、不易产生抗药性等优点，符合现代社会对农业生产及有害生物综合防治(IPM)的要求。

然而不同来源的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质含量差异较大，导致不同来源枯草芽孢杆菌菌株在抑菌效果方面表现出显著差异性。此外，单纯生防菌发酵液防治苹果树腐烂病存在防治效果不稳定、拮抗菌抑菌物如何有效作用于病原菌等诸多问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种防治苹果树腐烂病的生防菌发酵液的制备方法，所得的生防菌发酵液可有效防治苹果腐烂病，对人畜相对安全、环境兼容性好、不易产生抗药性、伤口愈合快、病疤复发率低。

本发明从山西省苹果产区临汾市苹果园的果树枝干上分离筛选获得2株抑制苹果树腐烂病菌较好的菌株LF17、LF18，经菌株菌落特征、菌株显微特征及16SrDNA序列分析鉴定为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，该菌株保存于山西省农业科学院植物保护研究所菌种库，枯草芽孢杆菌LF17的保藏号为NO：SAASIPPLF17；枯草芽孢杆菌LF18的保藏号为NO：SAASIPPLF18

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种防治苹果树腐烂病的生防菌发酵液的制备方法，包括如下步骤：

S1、培养基的制备：

NA培养基：称取酵母浸膏10.0g，牛肉浸膏15.0g，MgSO₄·7H₂O0.5g，FeSO₄·7H₂O0.009g，琼脂粉8.5g，葡萄糖30g混合后，用酸度计测，加NaOH或HCl调节pH至6.5，加水定容至1L，分装于250mL三角瓶中，装瓶量为80mL，121℃高压蒸汽灭菌20min；

NB培养基：称取酵母浸膏10.0g，牛肉浸膏15.0g，MgSO₄·7H₂O0.5g，FeSO₄·7H₂O0.009g，葡萄糖30g混合后，用酸度计测，加NaOH或HCl调节pH至6.5，加水定容至1L，分装于250mL三角瓶中，装瓶量为80mL，121℃高压蒸汽灭菌20min；

S2、拮抗菌株的活化：

将菌株LF17、LF18的菌株接种在NA培养基上，25℃恒温培养2d，其中，枯草芽孢杆菌LF17的保藏号为NO：SAASIPPLF17；枯草芽孢杆菌LF18的保藏号为NO：SAASIPPLF18；

S3、拮抗菌株的液体培养：