[发明专利]纳米金修饰的石墨烯用于蛋白质N末端分离的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体为一种纳米金修饰的石墨烯用于蛋白质N末端分离的方法。本发明方法步骤为，首先合成纳米金修饰的石墨烯（G@PDA@Au），再对氨基封闭后的蛋白进行酶解，对酶解液进行巯基衍生后，利用G@PDA@Au对衍生上巯基的非N末端肽段进行去除，最后利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行蛋白质N末端的检测。本发明方法可以方便高效地去除非N末端肽段，提高蛋白质N末端肽段鉴定效果。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用纳米金修饰的材料用于蛋白质N末端分离的方法。

背景技术

蛋白质N末端的氨基酸起点常与数据库中的起始位点不同。蛋白质在翻译和加工过程中，N端可能涉及到RNA的剪切，多种可选的翻译起点，信号肽的切割，以及各种化学层面的翻译后修饰等过程，而导致蛋白质N末端的复杂性。鉴定蛋白质N末端序列对于理解蛋白质的生物功能等具有重要意义。

目前，蛋白质N末端的方法主要基于正向富集和反向去除策略。正向富集策略的主要原理是先在蛋白质N末端引入特异性基团，经胰蛋白酶酶切后，蛋白变成肽段，再利用相应的材料对蛋白质N末端进行特异性地分离。反相去除策略主要原理是先在蛋白质层面进行所有的氨基全封闭，经过胰蛋白酶酶切后，蛋白变成肽段，再利用非N末端肽段上的游离氨基，结合氨基反应材料去除非N末端肽段，并对蛋白质N末端肽段进行分离富集。反相去除方法相较正向富集方法，有望富集到更多因化学修饰而导致游离氨基封闭的N末端，然而，去除材料的效率相对略有不足。因此，许多研究合成不同的可离去基团修饰的材料，包括三氟乙磺酸基材料等，利用氨基的亲核性对非N末端肽段进行去除。

为进一步提高非N末端肽段去除效率，需要探索更高效的去除材料。有文献表明，利用特劳特试剂（Traut’s Reagent）可以对氨基进行高效快速的巯基衍生，而同时，利用金和硫可以在温和的条件下形成牢固的金硫键。巯基衍生和金硫键形成均为加成反应，因此，体系中不会引入多余的盐类，减少除盐过程中样品损失，且不影响质谱的鉴定。若体系中的非N末端肽段可以得到高效的巯基衍生并被金修饰的材料分离，则可以实现蛋白质N末端的高效分离鉴定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种纳米金修饰的石墨烯用于蛋白质N末端分离的方法。

本发明提供的纳米金修饰的石墨烯用于蛋白质N末端分离的方法，具体步骤为：

首先，合成纳米金修饰的石墨烯（G@PDA@Au）；

然后，对蛋白上的所有游离氨基进行封闭，再对封闭蛋白进行溶液酶解；

然后，用特劳特试剂对非N末端肽段进行巯基衍生，加入纳米金修饰的石墨烯对含巯基的非N末端肽段进行分离富集；

最后，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-ToF）进行蛋白质N末端的检测。

本发明中，所述合成纳米金修饰的石墨烯的具体步骤如下：

（1）取一定质量石墨烯分散在10 mM Tris-HCl中，再加入4-10重量的多巴胺，室温下搅拌4-12 h；

（2） 将多巴胺包覆的石墨烯（G@PDA）经离心后，用水和乙醇交替洗涤数次，再在真空下烘干4-16 h；

（3）取一定质量G@PDA分散在50-100 ml 水中，加入终浓度为0.1-0.5 mM无水合氯金酸，加热至85-90℃后，加入5-10 mM柠檬酸三钠，保持加热1小时以上（一般为1-2小时），经离心，用水和乙醇交替洗涤数次后，用真空干燥，得到纳米金修饰的石墨烯。

本发明中，所述对蛋白上的所有游离氨基进行封闭，再对封闭蛋白进行溶液酶解的具体步骤日下；