[发明专利]同时检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时荧光PCR引物探针组合及方法

权利要求书

1.一种同时检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时荧光PCR引物和探针的组合物，所述引物和探针的组合物包括：

Neo F：5′-CCCTCGGTGGGGCAAAG-3′；

Neo R：5′-CCAACTCGGCGGCTTCC-3′；

MAL-P：FAM-TCATCATCATTTTCATCATC-MGB；

PER-P：CY5-CGCGTATCGCAACATCATCATTTTCATCAT-BHQ2；

ALB-P：NED-AAGATGTTCAACCCCTCCCTCGCGTA-BHQ1；

KIE-P：HEX-TGACCACTTGATGATCTC-MGB；

其中，FAM、CY5、NED、HEX为荧光基团，MGB、BHQ1、BHQ2为猝灭基团。

2.用于实时荧光PCR检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的引物和探针的组合物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的至少一种。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阳性对照。

5.一种同时检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时荧光PCR方法，包括以下步骤：

1）提取待检测样品中的DNA；

2）以步骤1）中提取的DNA为模板，采用引物和探针的组合物，进行实时荧光PCR扩增反应；

3）分析Ct值；

其中，所述引物和探针的组合物包括：

Neo F：5′-CCCTCGGTGGGGCAAAG-3′；

Neo R：5′-CCAACTCGGCGGCTTCC-3′；

MAL-P：FAM-TCATCATCATTTTCATCATC-MGB；

PER-P：CY5-CGCGTATCGCAACATCATCATTTTCATCAT-BHQ2；

ALB-P：NED-AAGATGTTCAACCCCTCCCTCGCGTA-BHQ1；

KIE-P：HEX-TGACCACTTGATGATCTC-MGB。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，实时荧光PCR反应体系以20 μL计为：

模板DNA 50 ng，

引物 每条引物的终浓度均为0.5 μmol/L，

探针 每条探针的终浓度均为0.25 μmol/L，

2×Thunderbird Probe qPCR Mix 10 μL，

ddH₂O 补足至20 μL；

其中，2×Thunderbird Probe qPCR Mix内含DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂、反应缓冲液、ROX。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，实时荧光PCR反应条件为：95℃ 10分钟；94℃ 15秒， 60℃ 60秒，共40个循环，每个循环结束后在FAM、CY5、NED、HEX通道下检测荧光信号。