[发明专利]同时检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时荧光PCR引物探针组合及方法

说明书

本发明提供一种用于同时检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时荧光PCR引物探针组合，所述引物探针组合的序列分别如SEQ ID No.1‑6所示。本发明还基于所述引物探针组合建立了同时检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时荧光PCR方法，可实现对引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的检测。本发明的实时荧光PCR引物探针组合及检测方法特异性好、通量高、快速，提高了检测效率，为引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的检测提供了更有效的方法。

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术，具体地说，涉及一种同时检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时荧光PCR引物探针组合及方法。

背景技术

苹果牛眼果腐病(Bull’s-eye rot of apple)是我国关注的进境水果真菌病害，病原菌包括Neofabraea malicorticis、N.perennans、N.alba和N.kienholzii这4个种，其中N.malicorticis(异名：Pezicula malicorticis)被列入我国进境植物检疫性有害生物名录中。苹果牛眼果腐病是苹果和梨重要的采后病害，难以防控，不仅为害果实，导致严重的采后损失，而且可侵害枝条、树干，导致树势衰弱、幼树死亡。其在世界范围内广泛分布，但尚未在我国发现。该病一旦传入我国，在我国苹果产区扩散、定殖的可能性很大，将对我国苹果生产造成严重威胁，十分必要加大口岸检疫力度，严防该病菌的传入。然而，苹果牛眼果腐病菌相似的形态特征和生理特性使这些病原菌的区分非常困难，要求鉴定者必须具备丰富的真菌分类学基础与经验。加之传统检验方法周期长，不符合进境水果快速通关的要求，使其成为进境水果真菌病害检疫的瓶颈。因此建立快速准确的检测体系尤为必要。

近年随着分子生物学技术的迅速发展，大量以PCR为基础的技术广泛地运用到植物病原菌的鉴定中，大大提高了鉴定的速度和准确性。实时荧光PCR结合了荧光检测系统和PCR扩增系统，通过荧光放大检测信号，在PCR扩增的过程中就能检测模板DNA的扩增，不需要凝胶电泳分析，简化了检测程序，与常规的PCR比较更能缩短检测周期。而且其检测特异性强，灵敏度高，其运用范围越来越广泛。

发明内容

本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种特异性好、灵敏度高的同时检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时荧光PCR引物探针组合。

本发明的另一个目的是提供一种用于实时荧光PCR检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的试剂盒。

本发明的再一个目的是提供同时检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时荧光PCR方法。

为了实现本发明目的，本发明提供了一种同时检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时荧光PCR引物探针组合，该引物探针组合包括以下引物：

Neo F：5′-CCCTCGGTGGGGCAAAG-3′；

Neo R：5′-CCAACTCGGCGGCTTCC-3′；

MAL-P：FAM-TCATCATCATTTTCATCATC-MGB；

PER-P：CY5-CGCGTATCGCAACATCATCATTTTCATCAT-BHQ2；

ALB-P：NED-AAGATGTTCAACCCCTCCCTCGCGTA-BHQ1；

KIE-P：HEX-TGACCACTTGATGATCTC-MGB；

其中，FAM、CY5、NED、HEX为荧光基团，MGB、BHQ1、BHQ2为猝灭基团。