[发明专利]一种无血清的脐带间充质干细胞培养基

权利要求书

1.一种无血清的脐带间充质干细胞培养基，其特征在于包括基础培养基和添加成份；其中，基础培养基为DMEM培养基，添加成份及其含量如下：

碱性成纤维生长因子hFGF：1-20ng/mL；

表皮生长因子hEGF：1-20μg/mL；

胰岛素hI：1-20μg/mL；

白血病抑制因子hLIF：0.1-5ng/mL;

L-谷氨酰胺：1-10mM；

2-巯基乙醇：50-200μM；

亚硒酸钠：20-50nM；

转铁蛋白：10-30μg/mL；

人白蛋白：10-100mg/mL；

纤连蛋白：50-200μg/mL；

黄芪多糖APS：50-200μg/mL。

2.一种如权利要求1所述的无血清的脐带间充质干细胞培养基，添加成份及其含量如下：

碱性成纤维生长因子hFGF：5-15ng/mL，优选10ng/mL；

表皮生长因子hEGF：5-15μg/mL，优选10μg/mL；

胰岛素hI：5-18μg/mL，优选10μg/mL；

白血病抑制因子hLIF：0.5-2.5ng/mL，优先1ng/mL;

L-谷氨酰胺：5-8mM，优选5mM；

2-巯基乙醇：80-150μM，优选100μM；

亚硒酸钠：25-40nM，优选30nM；

转铁蛋白：15-25μg/mL，优选25μg/mL；

人白蛋白：30-80mg/mL，优选50mg/mL；

纤连蛋白：80-150μg/mL，优选100μg/mL；

黄芪多糖APS：80-150μg/mL，优选100μg/mL。

3.一种脐带间充质细胞的传代培养及扩增的方法，其特征在于该实验方法的步骤是：

（一）首先制备如权利要求1～2任一项的无血清的脐带间充质干细胞培养基；

（二）传代培养及扩增步骤：

a.把经常规法分离所得并液氮保存的脐带间充质干细胞冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动，2min内即可溶解，同时预热上述无血清的脐带间充质干细胞培养基；

b．把经37℃解冻后的脐带间充质干细胞吸到装有9mL培养基的15mL的离心管中，同时用培养液洗2次冻存管，一起加到离心管中吹匀，避免产生泡沫，然后250倍重力的转速离心5分钟；

c．弃上清液，分别加2mL预热的的上述培养基，轻轻吹匀，保证细胞完全悬浮起来；将重悬的细胞接种到T25的培养瓶中，加入适量的培养液，再把细胞摇均匀，保证所有的细胞能够均匀的分布；

d．标好细胞种类和日期、培养基种类等，放入37℃、5%CO₂培养箱中；

e.细胞贴壁后换培养基，保证去除死细胞；

培养皿中的细胞覆盖率达到80%～90%时按1:3的比例传代至细胞培养板中，传代使用的生长培养基为本发明培养基；显微镜下观察脐带间充质干细胞生长状况；拍照纪录；

f.传至第2代时，MTT法检测细胞活性绘制细胞生长曲线，具体操作：将生长至80％融合度的第2代脐带间充质干细胞酶解悬浮，调整细胞浓度至1×10⁴个/mL，加入24孔板，每孔800μL，置于37℃、饱和湿度、5％的CO₂培养箱中培养，每隔6小时取出一份24孔板，每孔加入80μL浓度为5g/L的MTT溶液后，37℃下放置4h，在每孔加入600μL的二甲基亚砜DMSO，用酶标仪在550nm处测定各孔吸光光度OD值，以OD值代表细胞的相对数量，绘制生长曲线，纪录结果。

4.如权利要求3所述的一种脐带间充质细胞的传代培养及扩增的方法，其特征在于该方法进一步包括步骤（三）培养细胞的表面标记分析的试验步骤：取P2代的细胞，去掉培养液，PBS洗涤2次，用1:1的0.05%质量浓度胰蛋白酶液消化，1000r/min离心5min，用PBS洗涤1次，调整细胞浓度，制成浓度为106/mL的单细胞悬液，加入10μL抗体，在4℃下孵育30min，用PBS洗涤1次，1000r/min离心5min，用500μL的PBS重悬细胞，然后上流式细胞仪检测，进行对比。