[发明专利]一种无血清的脐带间充质干细胞培养基

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体地说是一种无血清的脐带间充质干细胞培养基。

背景技术

脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多能干细胞，细胞表面强表达特异性标记CD90，CD73，CD105，而不表达造血系或内皮系细胞的标记CD45、CD14、CD11、CD34、CD19，低表达或不表达主要组织相容性抗原HLA-DR。研究显示，脐带间充质干细胞具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化如骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等。与骨髓间充质干细胞相比，脐带间充质干细胞含量和增殖能力均优于后者，且免疫原性低、取材方便、无伦理学争议等优点，因此在间充质干细胞中具有更高的临床应用价值。

在实际临床应用中，无外源性污染和细胞数量是保证脐带间充质干细胞治疗的必要因素。目前，脐带间充质干细胞的培养体系大都含有动物血清(如胎牛血清)，一方面由于血清中不明蛋白的存在，对细胞的信号转导和细胞表面标志形成干扰，另一方面采用添加血清培养的干细胞进行体内移植，可能引起病原体的交叉感染，因此需要开发化学成分明确的无血清培养基。目前，市场上存在的无血清干细胞培养基用于培养脐带间充质干细胞培养时，一部分由于无血清培养基组成方面的不足，生长速度慢，容易出现老化的特征影响细胞的大量扩增，一部分培养基中添加了昂贵的抗体等特殊因子，增加了脐带间充质干细胞扩增成本。以上弊端一定程度上阻碍了脐带间充质干细胞的临床治疗应用。

发明内容

本发明的技术任务是解决现有技术的不足，提供一种无血清的脐带间充质干细胞培养基，克服血清外源性污染缺陷和细胞扩增数量与降低成本之间的矛盾问题。

本发明的技术方案是按以下方式实现的，一种脐带间充质细胞在无血清的脐带间充质干细胞培养基中传代培养及扩增的实验方法，该实验方法的步骤是：

(一)首先制备无血清的脐带间充质干细胞培养基，该无血清的脐带间充质干细胞培养基包括基础培养基和添加成份；其中，基础培养基为DMEM培养基，添加成份及其含量如下：

碱性成纤维生长因子hFGF：1-20ng/mL；

表皮生长因子hEGF：1-20μg/mL；

胰岛素hI：1-20μg/mL；

白血病抑制因子hLIF：0.1-5ng/mL；

L-谷氨酰胺：1-10mM；

2-巯基乙醇：50-200μM；

亚硒酸钠：20-50nM；

转铁蛋白：10-30μg/mL；

人白蛋白：10-100mg/mL；

纤连蛋白：50-200μg/mL；

黄芪多糖APS：50-200μg/mL。

(二)脐带间充质细胞在上述培养基中传代培养及扩增的实验步骤是：

a.把经常规法分离所得并液氮保存的脐带间充质干细胞冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动，2min内即可溶解，同时预热上述无血清的脐带间充质干细胞培养基；

b.把经37℃解冻后的脐带间充质干细胞吸到装有9mL培养基的15mL的离心管中，同时用培养液洗2次冻存管，一起加到离心管中吹匀，避免产生泡沫，然后250倍重力的转速离心5分钟；

c.弃上清液，分别加2mL预热的的上述培养基，轻轻吹匀，保证细胞完全悬浮起来；将重悬的细胞接种到T25的培养瓶中，加入适量的培养液，再把细胞摇均匀，保证所有的细胞能够均匀的分布；

d.标好细胞种类和日期、培养基种类等，放入37℃、5％CO₂培养箱中；

e.细胞贴壁后换培养基，保证去除死细胞；

培养皿中的细胞覆盖率达到80％～90％时按1:3的比例传代至细胞培养板中，传代使用的生长培养基为本发明培养基；显微镜下观察脐带间充质干细胞生长状况；拍照纪录；

f.传至第2代时，MTT法检测细胞活性绘制细胞生长曲线，具体操作：将生长至80％融合度的第2代脐带间充质干细胞酶解悬浮，调整细胞浓度至1×10⁴个/mL，加入24孔板，每孔800μL，置于37℃、饱和湿度、5％的CO₂培养箱中培养，每隔6小时取出一份24孔板，每孔加入80μL浓度为5g/L的MTT溶液后，37℃下放置4h，在每孔加入600μL的二甲基亚砜DMSO，用酶标仪在550nm处测定各孔吸光光度OD值，以OD值代表细胞的相对数量，绘制生长曲线，纪录结果；

(三)培养细胞的表面标记分析的试验步骤是：