[发明专利]一种莲藕茎尖组织初代培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种莲藕茎尖组织初代培养方法，属于农业、生物技术领域。

背景技术

植物组织培养是指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。该技术在快速繁殖珍稀植物或高经济价值的植物、植物体脱病毒和植物种质资源的保存等方面有广泛的应用前景。

莲藕是无性繁殖植物，母体植株易产生地下茎，地下茎的节上能产生新的植株，繁殖出后代。这一繁殖方法,容易将母体的病害及生理障碍等传递给后代,并且会逐代积累,导致后代植株的产量和品质下降。利用莲藕茎尖组织进行人工培养繁殖后代，可以有效防止病源的传播，确保后代能保持优良种性。莲藕茎尖组织培养分初代培养、增殖培养，生根培养和驯化等4个步骤，其中茎尖组织初代培养是指将莲藕茎尖组织接种到特定的培养基上获得无病源植株的过程，是获得无病源植株的重要步骤，也是莲藕茎尖组织培养的关键技术。

目前莲藕茎尖初代培养中存在的问题是：接种后茎尖组织易发生褐变率高，新生叶的叶片不能展开，叶柄不能伸长,生长畸形，接种成活率低，变异率高，成苗率低。

发明内容

本发明的目的是提供一种莲藕茎尖组织初代培养方法。该方法能使莲藕茎尖顶端分生组织的成苗率达到90％以上。

申请人经研究发现：莲藕茎尖组织初代培养过程可以分为外植体膨大和茎叶生长两个阶段。

现有的莲藕茎尖组织培养方法，采用的是固体培养基培养，接种后外植体易发生褐变死亡。经申请人研究和实验，发现不同类型的培养基及培养方式对外植体的褐变和膨大存在明显差异，研制出了莲藕外植体膨大培养基，采用该培养基进行液体震荡培养可以防止褐变的发生，使外植体的褐变率降低到5％以内。

现有的莲藕茎尖组织培养方法，茎尖组织接种后发育异常,新生叶的叶片不能展开，叶柄不能伸长,生长畸形。申请人经过大量的研究和实验，发现培养基对莲藕茎叶展开有显著的影响，研制出了莲藕茎尖组织展叶培养基，外植体接种后在膨大培养基中培养30-40d后，转换到莲藕展叶培养基中培养，可以防止畸形发生，使膨大的外植体组织能正常生长发育。

基于上述研究，本发明通过采用适宜的培养基及培养的方法来防止外植体组织褐变；通过采用展叶培养基防止叶片畸形变异的发生，使其茎叶发育；其具体技术方案如下：

一种莲藕茎尖组织初代培养方法，包括如下步骤：

1.莲藕芽体的采集：采集时间为5-8月，选取地下茎的顶芽；

2.芽体的前处理：将顶芽留取顶部3-5cm，用84消毒液处理及流水清洗；

3.消毒与接种：消毒和接种均在超净工作台内进行，具体如下：

3.1消毒：

3.1.1用75％的酒精消毒30秒；

3.1.2有效氯浓度为1％的次氯酸钠溶液，消毒30分钟；

3.1.3灭菌水清洗后，备用；

3.2接种：

3.2.1外植体的摘取：在放大倍数为10-40x解剖镜下由外向内依次剥除生长点外围包裹的叶片，直到生长点暴露。

3.2.2用解剖针针尖挑取生长点上部组织，接种到莲藕膨大培养基中：培养基的组成是：1/2MS+NAA(0.1-0.3mg/L)+BA(0.2-0.5mg/L)+蔗糖(3％)，pH为5.8-6.0；培养容器为直径为25mm的试管，培养基用量为15-20ml。

4.茎尖组织膨大培养：接种好的试管放置在旋转震荡摇床上进行震荡培养，振速为2rmp，培养条件温度23-25℃，光强2000-3000lx，光照时间为16hr；培养周期30-40d形成膨大的芽体；

5.展叶培养：

茎尖组织在膨大培养基培养30-40d后，将培养基更换成展叶培养基，培养基的组成是MS+BA(0.1-0.3mg/L)+GA(0.2-0.5mg/L)+蔗糖(5％)，pH为5.8-6.0；培养容器为300ml三角瓶，培养基用量100ml，培养条件温度23-25℃，光强2000-3000lx，光照时间为16hr，培养周期40-50天。

步骤1)中，为了保证品种的纯度，芽体采集要在品种园中进行，采集长度为5-10cm，以确保匍匐茎的质量。

步骤2)中的前处理是用400倍84消毒液浸泡芽体10-15分钟，再用蒸馏水冲洗10-15分钟，前述400倍是指用水按400：1的体积比稀释84消毒液。

步骤2)中从头部剪取匍匐茎3-5cm的原因是便于消毒接种时操作方便；

步骤3)中用灭菌水清洗3-5次。