[发明专利]鸟胞内分枝杆菌复合群检测用引物和探针、以及其检测方法在审

专利信息
申请号: 201510801925.0 申请日: 2015-11-19
公开(公告)号: CN105219882A 公开(公告)日: 2016-01-06
发明(设计)人: 李光;马志远 申请(专利权)人: 北京利德曼生化股份有限公司
主分类号: C12Q1/68 分类号: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/325
代理公司: 北京风雅颂专利代理有限公司 11403 代理人: 王安娜;李翔
地址: 100176 北京市*** 国省代码: 北京;11
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摘要:
搜索关键词: 鸟胞内 分枝杆菌 复合 检测 引物 探针 及其 方法
【说明书】:

技术领域

发明涉及分子生物学领域,特别是指一种鸟胞内分枝杆菌复合群检测用引物和探针、以及其检测方法。

背景技术

非结核分枝杆菌广泛存在于自然界的土壤,尘埃,水,鱼类和家禽中,传播途径主要从环境中获得感染,例如污水,而人与人之间的传染极少见。通常此类分枝杆菌对人类致病性较结核分枝杆菌低,但如果存在易感因素,使宿主局部或全身免疫功能发生障碍,则可导致病变。非结核分枝杆菌其中以鸟胞内分枝杆菌复合群(M.aviumcomplex)堪萨斯分枝杆菌(M.Kartsasii)和蟾蜍分枝杆菌(M.xenopi)为引起肺部病变的最常见致病菌。

鸟分枝杆菌病是由鸟-胞内分枝杆菌复合体(Mycobacteriumaviumcomplex或Mycobacteriumavium-intracellularecomplex,MAIC)感染引起的人兽共患性传染病。MAIC感染后可侵害多种组织器官包括肺、骨髓和淋巴结等。临床病症主要包括单一的结节、结节状的支气管扩张、结节样的浸润和在免疫力低下患者中的扩散性浸润四种类型。

目前,实验室里鉴定分枝杆菌采用的方法为涂片法和培养法。涂片法不能将结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌分开;培养法准确但需要培养2-3次才能确认,且耗时过长。近些年来也出现了一些针对鸟胞内分枝杆菌复合群的分子生物学鉴定方法,但也均需4-6个小时,如反向杂交,PCR-RFLP等,且容易出现实验室污染。

发明内容

有鉴于此,本发明的目的在于提出一种鸟胞内分枝杆菌复合群检测用引物和探针、以及其检测方法。

基于上述目的本发明提供的用于检测鸟胞内分枝杆菌复合群的引物,包括用于检测鸟分枝杆菌的上游引物和下游引物,其核苷酸序列分别为序列表中的SEQIDNO.1和SEQIDNO.2;以及用于检测胞内分枝杆菌的上游引物和下游引物,其核苷酸序列分别为序列表中的SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。

由上述引物衍生的引物序列也属于本发明的保护范围。所述衍生序列是指在SEQIDNO.1和/或SEQIDNO.2,以及SEQIDNO.3和/或SEQIDNO.4的基础上经过一至十个碱基的取代、缺失或添加得到的引物序列。

基于相同的发明构思,本发明还提供了用于检测鸟胞内分枝杆菌复合群的Taqman探针,包括具有序列表中SEQIDNO.5和SEQIDNO.6的两个Taqman探针;两个所述探针的5’端标记有报告荧光基团,3’端标记有淬灭荧光基团。

较佳的,所述具有序列表中SEQIDNO.5的探针的5’端标记JOE,3’端标记BHQ;所述具有序列表中SEQIDNO.6的探针的5’端标记FAM,3’端标记BHQ。

由上述Taqman探针序列的衍生序列也属于本发明的保护范围。所述衍生序列是在SEQIDNO.5和/或SEQIDNO.6的基础上,在序列的5’端和/或3’端添加一个或多个碱基得到的序列。

基于相同的发明构思,本发明还提供了鸟胞内分枝杆菌复合群检测试剂盒,包括用于检测鸟胞内分枝杆菌复合群的引物和Taqman探针。

基于相同的发明构思,本发明还提供了一种检测鸟胞内分枝杆菌复合群的方法,采用上述用于检测鸟胞内分枝杆菌复合群的引物和上述用于检测鸟胞内分枝杆菌复合群的Taqman探针,以待检测样本基因组DNA为模板,进行荧光定量PCR,其步骤如下:

1)提取待检测样本基因组DNA;

2)配置荧光定量PCR反应体系:模板5μl,10×Taq酶buffer5μl,2.5mMdNTP4μl,用于检测鸟分枝杆菌的上游引物和下游引物各2μl,其浓度均为10μM,用于检测胞内分枝杆菌的上游引物和下游引物各2μl,浓度为10μM,序列表中SEQIDNO.5和SEQIDNO.6的两个Taqman探针各1μl,浓度均为10μM,Taq酶2.5U,UNG酶0.01μl,ddH2O补至50μl;

3)进行PCR反应:反应条件为:50℃2min;94℃5min;94℃30s,60℃40s,共40个循环;在荧光定量PCR仪上进行扩增,收集信号。

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