[发明专利]一组不同启动子介导的蛋白酶高通量筛选载体及筛选方法有效
| 申请号： | 201510802312.9 | 申请日： | 2015-11-19 |
| 公开（公告）号： | CN105349569B | 公开（公告）日： | 2020-05-12 |
| 发明（设计）人： | 易犁;周瑜;张桂敏;彭文舫;马立新;马延和 | 申请（专利权）人： | 湖北大学 |
| 主分类号： | C12N15/81 | 分类号： | C12N15/81;C12N15/66;C12Q1/6897;C12Q1/37;C12Q1/02;C12R1/865 |
| 代理公司： | 武汉帅丞知识产权代理有限公司 42220 | 代理人： | 朱必武 |
| 地址： | 430062 湖北*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一组 不同 启动子 蛋白酶 通量 筛选 载体 方法 | ||
1.一种蛋白酶高通量筛选方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
A、构建含有不同GALX的空白重组载体，所述空白重组载体为pBDYD-GALX，其结构为GALX-pESD-HA-FLAG-Aga2-GAL1/GAL10-Aga2-FLAG-HA，所述的GALX为控制蛋白酶按照不同强度表达的启动子，所述的GAL1/GAL10为控制底物表达的双向启动子，所述的Aga2为表面展示蛋白，所述的FLAG和HA为抗体标签；根据启动子GALX的不同，该重组载体通能调节蛋白酶与其底物浓度比例在1:2至1:100之间变化；所述的GALX包括Gal4pBS2、Gal4pBS2/4、Gal4pBS1、Gal4pBS3、GAL1、LEUM、TEF、CYC、GPD；
B、在步骤A所得空白重组载体的基础上，通过添加蛋白酶突变体库构建方法产生的具有不同生化表征的蛋白酶突变体基因片段，以及添加底物的基因片段，构建蛋白酶高通量筛选载体，并转化得到含不同转录强度启动子的高通量筛选工程菌；所述的蛋白酶高通量筛选载体的结构为GALX-protease-pESD-HA-substrate-FLAG-Aga2-GAL1/GAL10-Aga2-FLAG-substrate-HA，所述的protease为蛋白酶突变体，所述的substrate为底物；
C、含不同转录强度启动子的高通量筛选工程菌的诱导表达；
D、流式细胞仪检测底物与酶在不同比例时的荧光信号强度，从而得到高活性的蛋白酶突变体。
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