[发明专利]一组不同启动子介导的蛋白酶高通量筛选载体及筛选方法

说明书

本发明公开了一组不同启动子介导的蛋白酶高通量筛选载体及筛选方法。本发明通过在pESD载体上插入不同转录强度的启动子GALX，构建了GALX–pESD‑GAL1/GAL10‑Aga2‑FLAG‑HA重组质粒，在相应的启动子后插入底物序列与酶突变体库，利用荧光标记技术和流式细胞仪检测细胞表面展示的蛋白，根据细胞表面荧光的强弱，从而分析底物与酶的不同比例下底物的酶切情况。这种方法在蛋白酶进化过程中，可以控制酶与底物的浓度在1:2到1:100之间，利用启动子转录的强弱来逐步提高酶活，最终获得高活性的蛋白酶突变体。

技术领域

本发明涉及的是蛋白酶高通量筛选技术，具体涉及一组不同启动子介导的蛋白酶高通量筛选载体及筛选方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

蛋白酶是指通过断裂氨基酸的酰胺键来水解蛋白质的一类酶。蛋白酶的种类很多，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶等，这些酶在工业生产及日常生活中都有着广泛的应用。随着蛋白酶的需求量日益剧增，蛋白酶的筛选方法也在不断探索更新。

先前的蛋白酶筛选方法中，主要是通过观看水解圈的有无及水解圈的大小来筛选目标蛋白酶，这种方法操作简单但工作量大，使用范围很局限，只适合小量筛选蛋白酶。随后在分子生物学的基础上，研究人员为了获得高活性的蛋白酶，通过分子改造，构建蛋白酶突变体库，水解圈筛选蛋白酶的方法已经远远不能满足此需求。在这种技术需求下，高通量筛选应运而生。

蛋白酶高通量筛选是指在细胞水平上运用自动化仪器，经计算机分析处理数据，最终收集样品。这种方法具有高度灵敏性、操作样品量大等优势，在蛋白酶定向进化过程中大大缩短了筛选时间，减少了工作量。

在高通量筛选蛋白酶的方法发展历程中，Dr.Yi构建了一种带有双向启动子的质粒pESD[Yi,L.,Gebhard,M.C.,Li,Q.,Taft,J.M.,Georgiou,G.,and Iverson,B.L.“Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening(YESS)of combinatorial libraries”,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2013,110(18):7229-34]。在该载体中，蛋白酶基因及其底物基因分列于可被半乳糖诱导的双向启动子GAL1-GAL10两端，同时紧靠底物基因的两端带有特异性标记基因FLAG和HA。底物基因与其两端带有的特异性标记基因连接在酵母细胞表面展示蛋白Aga2基因之后，从而其蛋白表达产物可被Aga2转运到表面。FLAG基因的氨基酸序列为DYKDDDDK，而HA基因的氨基酸序列为YPYDVPDYA。在FLAG基因与HA基因的蛋白表达产物成功展示在酵母表面后，基于其氨基酸序列的特异性，其蛋白产物能被带有不同荧光分子的特异性抗体所识别，从而给予酵母细胞相应的荧光。根据蛋白酶与底物是否有酶切反应使酵母细胞具有不同荧光，这些带有不同荧光的酵母细胞通过流式细胞仪分析，可以根据不同的目的要求筛选富集特定的细胞得到高特异性和高活性的蛋白酶突变株。这种方法虽然能够广泛用于蛋白酶突变株的筛选，但是其广谱性仍存在不足，主要表现在酶动力学检测范围的局限性。