[发明专利]一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法

权利要求书

1.一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

步骤(1)、果汁饮料污染菌的培养及DNA模板提取：

将检测样品在无氧环境中26℃静置过夜富集培养；通过真空泵过滤收集细胞沉淀于滤膜上；将滤膜转移至反应试管，加入50mM EDTA 480 μ L 再加入10mg/mL溶菌酶120 μ L ，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液，之后采用试剂盒提取果汁饮料污染菌的DNA模板；

步骤(2)、多重PCR扩增：

将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行多重PCR扩增， 得到扩增产物；

所述的多重PCR扩增反应体系为20 μ L ， 由100nM正向混合引物2 μ L ，100nM反向混合引物2 μ L ，25mM的MgCl₂ 4 μ L ，5×PCR Buffer 4 μ L ，5U/μ L 的Taq聚合酶0.7 μL ，DNA模板1 μ L ，余量的双蒸水组成；其中引物体系为步骤(1)得到的SEQ ID NO.1～8引物体系；

步骤(3)、对含有上述扩增产物的分离体系进行毛细管电泳分离；

步骤(4)、检测鉴定：

步骤(2)中所得的扩增产物经过毛细管电泳分离时，通过多重基因表达遗传分析系统自动检索、收集样品中荧光信号判断是否在基因片段长度为160bp、192bp、201bp、247bp相应位置处出现特征峰；若在160bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有桔青霉(Penicillium citrinum)；若在192bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有酿酒酵母(Saccharomyces cereviseae)；若在201bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有酵母菌Dekera naardenensis；若在247bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有黑曲霉(Aspergillus niger)。

2.如权利要求1所述的一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法，其特征在于步骤(2)正向混合引物中SEQ ID NO.1引物、SEQ ID NO.3引物、SEQ ID NO.5引物、SEQ ID NO.7引物的浓度比为1:1:1:1，反向混合引物中SEQ ID NO.2引物、SEQ ID NO.4引物、SEQ ID NO.6引物、SEQ ID NO.8引物的浓度比为1:1:1:1。

3.如权利要求1所述的一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法，其特征在于步骤(2)所述的多重PCR扩增反应的条件是95℃预变性10min；以94℃30s；58℃30s；70℃1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温。

4.如权利要求1所述的一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法，其特征在于步骤(3)分离体系：1 μ L 所述步骤(2)中所得的扩增产物与体积含量为95％去离子甲酰胺38.5 μ L ，400bp DNA Marker 0.5 μ L 混合均匀。

5.如权利要求1所述的一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法，其特征在于步骤(3)分离条件：在50℃、6.0KV电压下，分离35min。