[发明专利]一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法

说明书

本发明公开一种可同时检测果汁饮料中污染菌的基因快速筛查方法。该方法包括果汁饮料污染菌的培养及DNA模板提取，然后通过采用高通量的多重PCR技术与高分辨率的毛细管电泳分离技术相结合的方式，从而实现检测样品中是否含有具有果汁饮料污染能力的污染菌。本发明相对于目前其他以PCR技术为基础的分子生物学检测手段，能够在一次反应中集成检测4种果汁饮料污染菌，节约了检测成本，节省了检测时间，检测时间由原7～14天缩短到8h。

技术领域

本发明属于果汁饮料中污染菌检测方法，特别是一种基于多重PCR技术以及毛细管电泳分离技术，涉及一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法，用于几种常见果汁饮料中污染菌的基因快速筛选方法。

背景技术

果汁是人们生活中喜爱的液体饮料之一，是以水果为原料经过物理方法如压榨、离心、萃取等得到的汁液产品。果汁饮料，尤其是纯果汁里富含身体必需的维生素和微量元素。随着消费者的健康意识增强，果汁饮料的消费量日益增加。

果汁饮料生产加工过程中可能会污染一些病原微生物，在运输和储存中，暴露于非冷藏环境会加剧污染菌的增殖，从而造成异味物质和引起果汁饮料浑浊，从而引起果汁饮料变质，危害消费者的健康。如何能够快速、有效的检测果汁饮料中是否存在污染菌成为本领域亟待解决的问题。

对于果汁饮料中微生物的检测方式主要分为两类，第一类是基于培养基的传统培养法，国内外大多数果汁饮料厂采用此类方法，但检测时间长，且只能定量不能定性到种属，因此无法及时指导生产技术人员对果汁饮料生产过程进行监控；第二类是基于PCR技术的分子生物学检测方法，PCR技术从核酸、基因水平极大地提高了检测效率及灵敏度，能够定性到种、属或一类目标菌，检测快速且定性能力强，因此无论对于成品果汁饮料质量的监控，或者生产过程问题的溯源排查，PCR技术的应用都具有广阔的前景和深远的意义，但一次反应只能检测一类微生物。

大量实验已证实，几种果汁饮料污染菌桔青霉Penicillium citrinum、酿酒酵母Saccharomyces cereviseae、酵母菌Dekera naardenensis、黑曲霉Aspergillus niger，可经受果汁巴氏杀菌过程而存活，从而对高温消毒处理后的果汁仍能造成危害。这几种污染菌的鉴别是一项较复杂的工作，这些微生物需要较长的培养孵育时间，检测过程复杂，因而有必要进行更快速的检测方法。但目前检测方法多为培养基的传统培养法，或者使用单重PCR对每个有害菌进行逐一检测，检测成本高、耗时费力，且不能一次反应得出检测结果，不利于大量样品的快速检测。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的缺陷，克服果汁饮料中几种污染菌检测技术操作繁琐，费时耗力等不足，提供一种由4对引物组成的引物体系，通过采用高通量的多重PCR技术与高分辨率的毛细管电泳分离技术相结合的方式，从而实现对果汁饮料中是否存在污染菌污染的检测。

本发明的技术方案是：

本发明针对4种污染菌对样品进行分析，若能检测出其中任一种污染菌，则说明样品中含有具有果汁饮料污染能力的污染菌。

一种果汁饮料污染菌的快速筛查方法，采用4重PCR同时扩增4种污染菌的基因，再通过毛细管电泳分离所述4重PCR扩增产物，所述4重PCR反应中应用引物SEQ ID NO.1-8。

本发明方法具体如下：

步骤(1)、果汁饮料污染菌的培养及DNA模板提取：

将检测样品在无氧环境中26℃静置过夜富集培养；通过真空泵过滤收集细胞沉淀于滤膜上；将滤膜转移至反应试管，加入50mM EDTA 480ul再加入10mg/ml溶菌酶120ul，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液，之后采用试剂盒提取果汁饮料污染菌的DNA模板；

步骤(2)、多重PCR扩增：