[发明专利]一种用于非治疗和非诊断目的检测线粒体tRNALeu(UUR)3253T>C突变的方法

说明书

一种用于非治疗和非诊断目的检测线粒体tRNALeu(UUR)3253T>C突变的方法。所述方法包括DNA的提取、特异性引物设计、特异性条带PCR扩增、专一性限制性内切酶BstEII酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定等。本发明实现了几小时内出结果，且一种酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列，结果准确。本发明还提供检测原发性高血压相关的线粒体tRNA^Leu(UUR)3253T>C突变检测试剂盒。检测所需仪器要求低、所需试剂成本小、所需操作简单易掌握、所用方法稳定，特异性好等优点。

技术领域

本发明涉及生物医学工程领域，具体涉及一种用于非治疗和非诊断目的检测线粒体tRNALeu(UUR) 3253T>C突变的方法。

背景技术

心血管疾病是全球造成死亡的首要原因，据世界卫生组织统计，2008年约有1730万人死于心血管病，到2030年，几乎有2330万人将死于心血管病，而高血压是心血管疾病的首位危险因素。高血压影响全世界超过三分之一的成年人，即大约10亿人，每年造成全世界900多万人死亡，其中半数死于心脏病和中风，高血压还可引起肾衰竭、盲症、血管破裂以及脑损伤。高血压按照发病原因可以分为原发性高血压和继发性高血压，原发性高血压约占所有高血压的90-95%。

线粒体是一种由两层膜包被的细胞器，是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷（ATP）的主要场所，为细胞的活动提供能量，所以有“细胞动力工厂”之称。除了为细胞供能外，线粒体还参与如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。

线粒体基因是人体内唯一的核外遗传物质。线粒体tRNA 基因突变是与原发性高血压相关的突变热点区域，2009年Guan MX等人发现，位于线粒体tRNA^Leu(UUR)基因4435A>G突变与原发性高血压相关（Yuqi Liu, Min-Xin Guan et al. Hypertention，2009;53:1083-1090），2011年又进一步在细胞功能水平证明线粒体tRNA^Leu(UUR)基因4435A>G可能影响原发性高血压的发生发展（ Zhongqiu Lu，Min-Xin Guan et al. Eur J Hum Genet，2011;19:1181-1186）。

目前对于突变检测最常用方法为第一代测序测序技术，但此技术对仪器要求高，操作繁琐且成本昂贵，结果误差大、敏感性差并且存在放射性核素污染；PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）是目前应用较广泛、相对成熟的检测方法，但操作繁琐, 操作过程中影响结果的不确定因素太多；近年来，变性高效液相色谱（DHPLC）和基因芯片的应用为点突变检测提供了思路，检测技术灵敏度和特异度均较高，自动化程度高，适合高通量检测，但涉及仪器昂贵，需专人操作，不适合广泛推广。因此，迫切需要一种快速、准确、操作简易的突变筛查方法应用与临床突变筛查。

发明内容

本发明通过酶切法进行线粒体tRNA^Leu(UUR) 3253T>C突变检测，克服了现有方法耗时长、操作难、成本高等缺点，提供线粒体tRNA^Leu(UUR) 3253T>C突变检测试剂盒，以及上述方法或上述的试剂盒在检测。

本发明采用的技术解决方案是：一种用于非治疗和非诊断目的检测线粒体tRNALeu(UUR) 3253T>C突变的方法，所述的方法包括以下步骤：

（1）提取全基因组DNA：运用蛋白酶K消化裂解蛋白质，酚-氯仿-异戊醇法，提取全基因组DNA；