[发明专利]一种分隔固定多种酶的方法

说明书

一种分隔固定多种酶的方法，属于固定化酶制备领域。本发明分为以下步骤：首先将酶A原位包埋固定在聚合物基材表面的三维网络之中；之后在可见光的照射下，固定有酶A的三维网络层表面的光感应休眠种重新产生表面自由基，引发混合有酶B的单体溶液进行二次活性接枝交联聚合，将酶B原位包埋固定在第一层表面的三维网络之中，形成第二层交联网络；重复上述步骤，可将不同的酶分别包埋在更多的网络层之中。固定化过程中可以保存大部分酶的活性。将不同的酶分开固定在不同的网络层之中，既可以避免相互干扰抑制，又可以共同完成一个复杂的化学反应。聚合物基材可以提高复合膜的机械强度，增强了酶膜的稳定性，更有利于酶膜的回收再利用。

技术领域

本发明属于固定化酶制备技术领域，具体涉及活性接枝交联聚合在聚合物基材表面分隔固定多种酶的方法。

背景技术

生物酶作为一种温和高效的催化剂在实验室研究以及工业化应用中都有着极其光明的前景。相比于化学反应而言，酶促反应的条件更加温和，操作更加简单，区域选择性更高，反应中副产物更少，而且很多化学方法难以合成的反应都可以通过一种或多种酶来完成。但是酶本身成本很高，游离酶稳定性较差，这成为阻碍其普及的瓶颈。为了进一步拓宽酶的应用范围，将生物酶固定化在基材上，具有以下优点：其一，固定化的基材由于和底物是分开的，因此可以避免酶对反应底物的混合污染；其二，由于酶本身价格昂贵，固定化酶可以实现对酶的回收利用，从而大大降低了反应的成本；其三，将酶固定化在基材表面可以增加酶的结构稳定性，使酶在实验室和工业化研究中更不易失活。

在形形色色的酶固定化载体选择上，以聚合物凝胶为载体的酶固定技术成为近年来的热点。但是，聚合物凝胶普遍存在机械强度较低的缺点，在实际应用中很容易被破坏而丧失其功能。除此之外，凝胶对外界环境比较敏感，在溶剂中易发生溶胀从而导致酶的泄露。为解决这些问题，使用可见光可控活性接枝的方法，在聚合物基材表面接枝一层致密而均匀的网布层，网布层相比于凝胶来说，溶胀性小，网络致密而均匀，包埋的酶不易发生泄漏。除此之外，由于聚合物基材与聚合物网布相似的柔韧度和卓越的机械强度，将网布接枝在聚合物基材上，制备具有支撑基质的聚合物网布/基材复合膜成为一种新型的制备高性能固定化酶的方法。

近年来，使用多种酶同时催化一个复杂体系的多种化学反应，或由一个起始物的多级转化反应是生物催化研究的热点方向之一，这就涉及到多酶的固定化技术。但目前专利和文献报道的大多是混合包埋法(这些酶之间不存在物理或化学负效应)：比如牛军峰等(CN 102716684 A)将用于污水处理的多酶体系混合包埋在聚乳酸/嵌段共聚物凝胶之中，再将凝胶进行电纺丝制得纤维膜，使用此固定化酶膜催化多种污水中的含氨氮有机物，效率较高而且性能较好。吴敏等(CN 101914520 A)构建了纳米凝胶-多酶组装体系，对甘油脱氢酶、甘油脱水酶和1，3-丙二醇氧化还原酶进行了固定，该方法成本低、反应简单，为多种酶提供了固定场所，是一种有效的纳米凝胶固定化酶催化合成的新方法。Zhao等(GreenChemistry,2014,16,2558)将葡糖氧化酶和葡糖淀粉酶混合固定在石墨烯氧化物上，利用该多酶共固定化的生物催化剂一步催化淀粉转变为葡萄糖酸的反应，两种酶的活性均保持在较高水平。

然而对很多复杂反应体系，当这些酶之间因存在物理或化学作用而互相影响生物活性时，需要分隔固定技术。如蛋白酶，当其与其他酶共同作用时，往往会分解其他酶(本质上是蛋白质)从而导致反应不能如期进行。但是，将相互抑制的多种酶分开固定在同一个基材上的报道则比较少见。

为解决将不同种酶特别是相互抑制的酶分开固定在同一基材上的问题，有必要设计出一种简单、条件温和的方法制备聚合物网布/基材复合膜，以实现在同一聚合物基材上对多种游离酶的分隔有效固定化。

发明内容

为克服上述现有技术的缺点，本发明的目的是提供一种利用活性接枝聚合的特点在聚合物基材表面接枝多层网布层用以分别固定多种游离酶的方法。该方法操作简单，条件温和，能够在制备网布/基材复合膜的同时实现对多种游离酶的分隔包埋。并且以多种酶为模型来证明分隔固定的有效性。