[发明专利]一种检测庆大霉素免疫亲和凝胶检测柱及其制备方法

权利要求书

1.一种检测庆大霉素免疫亲和凝胶检测柱，其特征在于：

凝胶检测柱的原理是利用抗原抗体的特异性结合和辣根过氧化物酶的酶催反应，依据质控层和检测层颜色变化，进而对待测物进行定性半定量分析。

2.根据权利要求1所述的一种检测庆大霉素免疫亲和凝胶检测柱，其特征在于：

在一个标准的1mL固相萃取柱内设有两层，上层为庆大霉素抗体胶与封闭胶混合加入形成的检测层，下层为HRP抗体胶与封闭胶混合加入形成的质控层，质控层和检测层之间隔开一个3mm的空气层。

3.一种检测庆大霉素免疫亲和凝胶检测柱的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)抗体胶的制备：CNBr活化的琼脂糖凝胶0.25g使用1mmol/LHCl20mL在具砂板层析柱中溶胀清洗15min，待凝胶完全溶胀后用偶联缓冲液调至中性；用1mL偶联缓冲液稀释抗体含量为0.5mg的缓冲液，在凝胶中悬起，室温下使用定向摇床振摇2h。之后使用10mL偶联缓冲液清洗凝胶，去除未偶联上的抗体；用甘氨酸封闭液将凝胶上的残余活性基团封闭，室温下在定向摇床振摇反应2h。反应完后清洗凝胶至少三次以调整其pH，每次清洗先用10mL醋酸钠缓冲液清洗，再用10mL偶联缓冲液清洗。制备好的凝胶用含有0.03％Proclin300的PBS以1:3(v/v)稀释重悬，4℃贮存；

(2)抗HRP胶的制备：将兔抗HRP多克隆抗体与凝胶偶联，用于凝胶检测柱的质控层。偶联步骤同(1)；

(3)封闭胶的制备：使用封闭的凝胶稀释抗体胶对抗体胶起物理支撑和分散的作用。制备过程如下：使用1mmol/LHCl80mL将CNBr活化的琼脂糖凝胶1g在具砂板层析柱中溶胀15min，待凝胶完全溶胀后用偶联缓冲液调至中性。然后加入20mL甘氨酸封闭液室温反应2h，以封闭凝胶上残余的基团。清洗和重悬步骤同(1)。

4.根据权利要求3所述的抗体胶和封闭胶制备方法进行检测柱的组装，其特征在于：

制作步骤为将聚乙烯垫片加入1mL的固相萃取柱中，然后加入200μL的HRP抗体胶与封闭胶比例为1:49的混合胶，加入第二层聚乙烯垫片，用注射器活塞将PBS压出，在组装好的质控层上方约3mm处加入第三层聚乙烯垫片，然后加入200μL的庆大霉素抗体胶与封闭胶比例为1:19的混合胶，最后在顶部加入第四层垫片，用注射器活塞将PBS压出。

5.根据权利要求4所述的组装好的庆大霉素免疫亲和凝胶检测柱，其特征在于：所述的庆大霉素免疫亲和凝胶检测柱检测庆大霉素的检测限为10μg/L。