[发明专利]一种信号肽及其在利用魔芋粉产γ-氨基丁酸重组菌中的应用

说明书

技术领域

利用一种信号肽使重组菌高效分泌特定酶代谢廉价碳源进行氨基酸生产的方法和高效生产某种蛋白的方法，属于基因工程、蛋白质与酶工程和代谢工程领域。

背景技术

魔芋粉，主要含魔芋葡甘露聚糖，其来源是非粮食作物魔芋。据相关报道在我国云南、贵州、四川、湖北和湖南的西部、陕西南部等地均适宜魔芋种植，目前已有一定的规模，仅湖北省魔芋种植面积就达41万亩。目前魔芋粉主要用于部分食品，其水解低聚糖可作为功能性食品，应用还不是很广泛。大部分微生物无法直接利用，因此，改造微生物利用魔芋作为碳源发酵生产高附加值产品具有良好的应用前景。现国内外已有报道，改造酿酒酵母直接以淀粉为碳源生产乙醇，导入α-淀粉酶基因使谷氨酸棒状杆菌利用可溶性生产L-赖氨酸的相关报道，未见有以魔芋粉底物的相关微生物改造。

本研究室前期工作已获得通过相关基因工程和代谢工程技术改造的一系列以葡萄糖糖为底物高产γ-氨基丁酸的菌种：天津短杆菌SW07-1/pGAD。

发明人获得的高产γ-氨基丁酸的菌种只能以葡萄糖为主要碳源发酵生产γ-氨基丁酸，不能直接利用魔芋粉作为主要碳源。

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid，GABA)是天然存在于某些生物体内的非蛋白质氨基酸，其为哺乳动物中枢神经系统重要的抑制性神经递质，具有抗焦虑、降血压、镇定安神、增强记忆、调节激素分泌、促进生殖、利尿，镇痛等生理功能，在食品、饲料、医药等领域都具有广泛的应用。通过基因工程和代谢工程技术进一步改造高产γ-氨基丁酸菌种，使其能利用魔芋粉作为碳源发酵生产γ-氨基丁酸。对简化γ-氨基丁酸生产工艺、节约生产成本有一定的参考应用价值。

发明内容

本发明通过基因工程技术将去除自身信号肽的β-甘露聚糖酶基因与来源谷氨酸棒状杆菌和枯草芽孢杆菌的Sec和Tat两个主要分泌途径的十二条信号肽分别融合，替换对比不同信号肽引导分泌β-甘露聚糖酶基因在不同γ-氨基丁酸高产菌的效果，得到经密码子优化的β-甘露聚糖基因信号肽——MannaseSignalPeptide(MSP)为分泌胞外酶效果较好的一种新发现信号肽。

所述MSP核苷酸序列是SEQIDN0.1所示的序列。

本发明在已有高产γ-氨基丁酸菌种的基础上，通过基因工程技术不同信号肽引导分泌β-甘露聚糖基因在构建的不同γ-氨基丁酸高产菌中表达。使其能以魔芋粉和葡萄糖作为混合碳源进行γ-氨基丁酸发酵。

本发明构建的重组天津短杆菌SW07-1/pGAD-pMSPman优化后5L发酵96hγ-氨基丁酸发酵的产量为45.5±0.9g/L，发酵液中β-甘露聚糖酶的酶活为1203±6.8U/mL。(碳源添加方式：初始10g/L魔芋粉和30g/L葡萄糖，后期分批补加80g/L魔芋粉。)

所述的技术方案：

1.根据NCBI上公布的相关基因序列设计信号肽和目的基因融合引物。

2.重组菌的构建

从相关菌种中抽提染色体DNA为模板，根据预先设计好的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行PCR。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，琼脂糖核酸凝胶电泳检验回收产物的浓度。用相同的限制性内切酶相关表达载体和纯化后的PCR产物进行双酶切，琼脂糖核酸凝胶电泳检测酶切产物并用凝胶回收试剂盒对其回收，并用超微量分光光度计检测其浓度。将酶切后的载体和PCR产物按一定比例混合，在T4DNA连接酶的作用下过夜连接。将连接产物用CaCl₂转化法转入E.coliBL21，获得含重组质粒的E.coliBL21。提取质粒，通过单双酶切及PCR验证后用电转化方法将重组质粒导入相关菌种中。最后，将含15％甘油的重组菌液保存-70℃冰箱。

3.重组菌的产酸培养

将重组菌接种于新鲜的LB+0.5％Glucose液体培养基中进行活化，接种量为1％。次日以1％转接于发酵培养基中(底物为魔芋粉和葡萄糖混合)，0.8mMIPTG诱导表达，生长后期收集发酵液利用氨基酸自动分析仪测定其氨基酸含量(γ-氨基丁酸及相关氨基酸等)。发酵培养基具备微生物生长所需的营养成分，并通过相关优化。

4.重组菌的产酶培养

将重组菌接种于新鲜的LB+0.5％Glucose液体培养基中进行活化，接种量为1％。次日以1％转接于发酵培养基中(底物为葡萄糖)，0.8mMIPTG诱导表达，生长后期收集发酵液测其酶活和蛋白含量。

具体实施方式

实施例1：信号肽引物与β-甘露聚糖酶串联的引物设计