[发明专利]一种蒙药香青兰组织培养再生体系建立的方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域植物组织培养方法，具体涉及蒙药香青兰组织培养再生体系的建立方法。

背景技术：

香青兰(DracocephalummoldavicaL.)，别名摩眼子，山薄荷，蓝秋花、玉米草、香花子，等。其质量标准分别收载于内蒙古蒙药材标准、卫生部药品标准维药分册，还曾收载于1977年版中国药典,唇型科青兰属一年生草本植物，药用部位为地上全草，主要分布于我国华北、东北、西北大部分地区，特别是内蒙古和新疆。蒙古名为毕日阳古，是极具开发潜力和民族特色的天然药用植物，具有缓解心绞痛、改善心肌缺血、降低血粘度和血小板聚集率等功效作用。除作为中草药外，香青兰因含有大量的挥发油，是制备柠檬香系香料的重要原料。此外，香青兰幼嫩的茎叶可作为特菜食用，干的茎叶和种子可制作茶、调味料或制作香料。香青兰以其蕴藏的多功能医疗保健作用和独具特色的香味成为一种极具开发潜力的天然药用植物资源和芳香植物资源。

近年来，随着国家“中药现代化与产业化开发”行动的推进，对香青兰的开发利用得到了迅猛发展，而原材料的获取主要靠野外采挖，野生香青兰的资源保护与抚育、引种与驯化正在全面展开。香青兰主要靠种子繁殖，但它的种子非常小，且不宜保存易丧失活力。植物组织培养与再生体系的建立是快速繁殖植物优良品种脱毒苗的重要途径，而对香青兰进行组织培养获得再生植株的研究至今未见报道。为及时有效的保护与开发蒙药香青兰，保证其可持续利用，本发明以香青兰无菌苗的下胚轴为外植体，通过愈伤组织诱导、分化、增殖、生根、炼苗、移栽等系列过程成功获得了香青兰再生植株,建立了组培快繁体系，为香青兰无性系育种及遗传转化、工厂化生产育苗满足市场需求提供理论基础和实践依据。

发明内容：

本发明提供一种蒙药香青兰组织培养再生体系建立的方法。

技术解决方案

所述的香青兰子叶愈伤组织再生体系的建立方法，包括以下步骤：

(1)种子表面消毒及无菌苗培养：

挑选籽粒饱满、大小一致的香青兰种子，经流水冲洗4-7min去除表面尘土杂物，无菌水冲洗4-7次后放置超净工作台上，用体积浓度70%乙醇浸泡30-40s，无菌水冲洗2-4次；再用体积浓度0.1%HgCl₂消毒4-6min，无菌水震荡冲洗4-6次，接种在含有100mLMS₀固体培养基的三角瓶中，将三角瓶瓶身用牛皮纸包裹，28±2℃条件下培养。每天观察种子的污染与萌发状况。待种子萌发后去除牛皮纸光照培养，光照12-14h/d，光照强度1800-22001ux。

(2)愈伤组织的诱导

取步骤(1)培养的生长健壮的香青兰无菌苗，切取无菌幼苗的子叶接种于诱导培养基MS₁上，每瓶接种3-4块，暗培养9-12d后转入正常光照下培养。诱导培养基MS₁以MS为基本培养基，添加6-BA0.5mg/L、2，4-D1.0mg/L、NAA0.5mg/L、蔗糖30mg/L、琼脂10mg/L,pH5.8-6.0，13-16d后观察并统计愈伤组织诱导率。诱导光照培养条件为：光照12-14h/d，光照强度1800-22001ux，温度28士2℃。

(3)愈伤组织的继代培养

将经过步骤(2)诱导得到的黄绿色愈伤组织接种在继代培养基MS₂中进行继代培养。继代培养基MS₂以MS为基本培养基，添加6-BA0.5mg/L、2，4-D0.5mg/L、NAA0.5mg/L、蔗糖30mg/L、琼脂10mg/L，pH5.8-6.0，继代培养条件为：光照12-14h/d，光照强度1800-22001ux，温度28士2℃。

(4)不定芽的诱导分化

将经过步骤(3)连续继代培养3-4次后得到的黄绿色愈伤组织转到不定芽分化培养基MS₃中进行诱导，不定芽分化培养基以MS为基本培养基，添加外源激素6-BA0.8mg/L、NAA0.1mg/L、蔗糖30mg/L、琼脂10mg/L，pH5.8-6.0，培养条件为：光照12-14h/d，光照强度1800-22001ux，温度28士2℃。

(5)诱导生根