[发明专利]一种基于微电极生物传感器的植株活体抗坏血酸检测方法

说明书

技术领域

本发明属于检测领域，具体涉及一种利用生物传感器检测抗坏血酸的方法。

背景技术

抗坏血酸是一种普遍存在于植物组织的高丰度小分子抗氧化物质。它可以直接与单线态氧、超氧自由基、过氧化氢和羟自由基等活性氧反应,因此在植物抵抗氧化胁迫中具有重要作用。同时抗坏血酸也是一些关键性酶的反应底物，因而抗坏血酸在植物的生长发育及植物对环境胁迫响应的过程中起着重要作用,有必要检测和监控植物组织中抗坏血酸含量。

目前抗坏血酸检测时常用经典的碘量法、液相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法、火焰原子吸收光谱法、分光光度法等。例如荧光分光光度法将植株鲜样加偏磷酸-乙酸溶液，打碎成匀浆，用偏磷酸-乙酸溶液稀释。取样品滤液加活性炭，再加入硼酸-乙酸钠溶液，进行荧光光谱检测。

虽然光谱、色谱、质谱检测方法准确度高，但对样品提取的纯度要求也较高，并且以上方法需要对植物材料进行离体取样，对样品前处理要求较高，通过检测浸提液中物质的浓度，所获取的结果是某一状态下的静态浓度，无法体现植物对环境变化的动态响应。

发明内容

针对现有技术中存在的不足之处，本发明的目的在于提供一种基于微电极生物传感器技术的植株活体抗坏血酸快速检测方法，以克服现有技术中样本前处理复杂、不可逆破坏样本、只能静态检测的缺陷。

实现本发明目的的技术方案为：

一种基于微电极生物传感器的植株活体抗坏血酸检测方法，包括步骤：

S1用微电极阵列构成微电极生物传感器，所述微电极阵列连接有信号采集模块和电化学工作站；

S2用微电极生物传感器测试抗坏血酸标准溶液，获取抗坏血酸浓度与电流信号关联的数学模型；

S3将微电极生物传感器插入待测的植株活体，获取植株活体对输入的电信号的响应，根据步骤S2的数学模型求得待测植株活体样品中抗坏血酸浓度。

其中，所述微电极阵列通过MEMS工艺设置在硅片基底上，硅片基底具有尖端部分，所述尖端部分上设置有对电极、工作电极和参比电极，所述工作电极为L-半胱氨酸、纳米金、壳聚糖修饰的金电极。

其中，对电极为铂电极，参比电极为Ag/AgCl电极。

优选地，硅片基底的长度为4～6cm，尖端部分长度为3～20mm；硅片基底的厚度为0.5～2mm，硅片基底另一端上设置有连接元件。

硅片基底上设置微电极阵列的方法采用MEMS标准工艺，在硅基底上涂布光刻胶，再根据制备的形状进行光蚀刻，将蚀刻掉部分电沉积金属，最后剥落蚀刻胶；

针对不同部位沉积不同金属，通过电化学沉积将微电极阵列中分别修饰成镀铂对电极、银/氯化银参比电极、镀金工作电极，获得包括对电极、工作电极和参比电极的微电极阵列，对电极、工作电极和参比电极设置在尖端部分，并导电连接位于硅片基底另一端的连接元件。

进一步地，所述工作电极的制备方法为：

1)配制10mmol/LL-半胱氨酸溶液，将它滴在金电极表面，在室温、湿度100％下修饰15～20h(静置15～20h)，后用去离子水清洗干净，得到L-半胱氨酸修饰的金电极；

2)将直径8～20nm纳米金溶胶滴涂在L-半胱氨酸修饰好的金电极上，在室温、湿度100％下修饰15～20h，后用去离子水清洗干净，得到纳米金修饰的金电极；

3)将抗坏血酸氧化酶超声溶解在含50～80％(质量百分比)壳聚糖溶液中，得浓度为0.1～2mol/L抗坏血酸氧化酶混合溶液，将该混合溶液滴涂在纳米金修饰好的金电极上，在2～5℃、湿度100％下修饰20～30h，后用去离子水清洗干净，得到工作电极，储存在0℃～10℃下。

本发明生物传感器制备过程中，金电极进行修饰之前，先用金相砂纸打磨至光滑，然后用去离子水超声清洗干净；将金电极置于0.5mol/L稀硫酸溶液中进行循环伏安扫描，扫描范围为-0.2～1.6V，得到典型的循环伏安谱图，证明电极表面干净；否则再次打磨和清洗。

纳米金的制备可以为：向40mL的蒸馏水中加入质量分数为2％的HAuCl₄溶液0.5mL，混匀，边加热变搅拌至沸，再加入10mL，10mmol·L^-1的柠檬酸钠溶液，可见溶液颜色由黄色变深蓝色直至酒红色，搅拌下继续加热10min，停止加热。