[发明专利]GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)GX1-PEG2000聚合物的制备

将荧光素标记的肽GX1和CH₃O-PEG2000-COOH按摩尔比1：(1～5)加入到纯净水中，37℃反应2～5小时后，将反应液提纯得到修饰后的聚合物GX1-PEG2000；

(2)阴离子脂质体的制备

将磷脂、琥珀酸胆固醇单酯以及胆固醇按摩尔比5：4：1溶于氯仿中，减压蒸发干燥4～6小时，将得到的干膜在TES缓冲液中水化，然后在冰水浴条件下超声处理1min，得到阴离子脂质体AL；

(3)通过钙诱导相变方法将腺病毒负载在阴离子脂质体上，得到载有腺病毒的阴离子脂质体；

(4)GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体的制备

将步骤(1)中得到的聚合物GX1-PEG2000与步骤(3)中得到的载有腺病毒的阴离子脂质体混合，在37℃下培养2小时后，得到GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体。

2.如权利要求1所述的GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述荧光素标记的肽GX1；

所述提纯具体为：将反应溶液用分子量为3kD截留量的超滤离心管，在转速为5000r/min条件下离心10分钟，重复离心四次。

3.如权利要求1所述的GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述琥珀酸胆固醇单酯的制备包括以下步骤：

A、将胆固醇和琥珀酸酐以及催化剂加入到二氯甲烷中，在65℃、氮气保护条件下，反应过夜；其中，所述胆固醇、琥珀酸酐、催化剂以及二氯甲烷的摩尔体积比为2mmol：4mmol：1mmol：20ml；

B、将步骤A中过夜后的反应液进行冷却、过滤后，用蒸馏水萃取；

C、将步骤B中水萃取后的下层溶液进行蒸发除去溶剂，并在50℃条件下干燥后，得到琥珀酸胆固醇单酯。

4.如权利要求3所述的GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体的制备方法，其特征在于，在步骤A中，所述催化剂为4-二甲氨基吡啶。

5.如权利要求1所述的GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述TES缓冲液包括100mMNaCl、组氨酸2mM、2mMTES，该TES缓冲液pH7.4；

所述超声处理具体为：用功率为200瓦时、以5对5的超声波进行处理。

6.如权利要求1所述的GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述腺病毒为肿瘤抑制基因PTEN表达的缺失E1、E3的复制缺陷型的重组腺病毒Ad，该重组腺病毒Ad由VGTC基因技术获得。

7.如权利要求6所述的GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述钙诱导相变方法具体包括以下步骤：将100mM氯化钙添加到阴离子脂质体AL中，阴离子脂质体AL的终浓度为10mM，在37℃下培养1小时；将培养液离心，将分离出的沉淀物以腺病毒载体浓缩液和TES缓冲液涡旋10分钟使之悬浮；将15mMEDTA直接添加到该悬浮液中，pH值至7.4，将该溶液涡旋10分钟后再培养30分钟后，得到载有腺病毒的阴离子脂质体。

8.权利要求1～7任一项所述制备方法得到的GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体在制备抑制癌细胞迁移、癌细胞增殖以及癌细胞血管内皮细胞增殖的药物方面的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述癌细胞为胃癌细胞。