[发明专利]GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于抗癌药物开发技术领域，尤其涉及一种GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体及其制备方法与应用。

背景技术

胃癌是第四个最普遍的恶性肿瘤疾病，它也是世界各地的癌症相关死亡的第二大原因(Ferlayetal.,2010)。在胃癌的早期和中期阶段，手术切除是最常见的治疗方法之一。然而，癌症最终复发，5年生存率仅为20～25％(Cidonetal.,2013)。随着肿瘤的生长，它会侵入到周围的组织或器官，并转移到身体的其他部位。虽然联合化疗能使生存率明显超过单化疗(Wagneretal.,2006)，平均存活期仍然在9到11个月不等(DeVitaetal.,2012)，总生存期仍低，5年生存率为30～36％。

新治疗方法的发展仍然是首要任务。在关于多种癌症分子通路的理解方面，其最近的进展引导了新靶向疗法的发现。这些靶向治疗策略包括表皮生长因子受体抑制剂，抗血管生成剂，细胞周期抑制剂，细胞凋亡的启动子和基质金属蛋白酶抑制剂(Ngeowetal.,2011)。一些有关细胞生长，侵袭，细胞凋亡，血管生成和转移瘤的因子正逐渐成为许多常见的恶性肿瘤的有希望的治疗策略。肿瘤血管靶向使抗癌药物更具选择性，通过它们有针对性的传递，从而提高治疗效率，同时降低全身毒性(Changetal.,2015；Liuetal.,2015；AbdollahiandFolkman,2010)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体及其制备方法与应用，旨在开发一种新的、疗效确切的抗癌药物。

本发明是这样实现的，一种GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)GX1-PEG2000聚合物的制备

将荧光素标记的肽GX1和CH₃O-PEG2000-COOH按摩尔比1：(1～5)加入到纯净水中，37℃反应2～5小时后，将反应液提纯得到修饰后的聚合物GX1-PEG2000；

(2)阴离子脂质体的制备

将磷脂、琥珀酸胆固醇单酯以及胆固醇按摩尔比5：4：1溶于氯仿中，减压蒸发干燥4～6小时，将得到的干膜在TES缓冲液中水化，然后在冰水浴条件下超声处理1min，得到阴离子脂质体AL；

(3)通过钙诱导相变方法将腺病毒负载在阴离子脂质体上，得到载有腺病毒的阴离子脂质体；

(4)GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体的制备

将步骤(1)中得到的聚合物GX1-PEG2000与步骤(3)中得到的载有腺病毒的阴离子脂质体混合，在37℃下培养2小时后，得到GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体。

优选的，在步骤(1)中，所述荧光素标记的肽GX1；

所述提纯具体为：将反应溶液用分子量为3kD截留量的超滤离心管，在转速为5000r/min条件下离心10分钟，重复离心四次。

优选的，在步骤(2)中，所述琥珀酸胆固醇单酯的制备包括以下步骤：

A、将胆固醇和琥珀酸酐以及催化剂加入到二氯甲烷中，在65℃、氮气保护条件下，反应过夜；其中，所述胆固醇、琥珀酸酐、催化剂以及二氯甲烷的摩尔体积比为2mmol：4mmol：1mmol：20ml；

B、将步骤A中过夜后的反应液进行冷却、过滤后，用蒸馏水萃取；

C、将步骤B中水萃取后的下层溶液进行蒸发除去溶剂，并在50℃条件下干燥后，得到琥珀酸胆固醇单酯。

优选的，在步骤A中，所述催化剂为4-二甲氨基吡啶。

优选的，在步骤(2)中，所述TES缓冲液包括100mMNaCl、组氨酸2mM、2mMTES，该TES缓冲液pH7.4；

所述超声处理具体为：用功率为200瓦时、以5对5的超声波进行处理。

优选的，在步骤(3)中，所述腺病毒为肿瘤抑制基因PTEN表达的缺失E1、E3的复制缺陷型的重组腺病毒Ad，该重组腺病毒Ad由VGTC基因技术获得。

优选的，在步骤(3)中，所述钙诱导相变方法具体包括以下步骤：将100mM氯化钙添加到阴离子脂质体AL中，阴离子脂质体AL的终浓度为10mM，在37℃下培养1小时；将培养液离心，将分离出的沉淀物以腺病毒载体浓缩液和TES缓冲液涡旋10分钟使之悬浮；将15mMEDTA直接添加到该悬浮液中，pH值至7.4，将该溶液涡旋10分钟后再培养30分钟后，得到载有腺病毒的阴离子脂质体。