[发明专利]一种提高酿酒酵母非偏好型氮源利用的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高酿酒酵母非偏好型氮源利用的方法，属于微生物遗传和分子生物学领域。

背景技术

氨基甲酸乙酯被认为是一种对人有潜在致癌性的物质，并在1974年被国际癌症研究机构(IARC)划为2B级的致癌化合物。此后，研究人员又发现氨基甲酸乙酯也可以直接诱发人的肝癌，进一步促使IARC在2007年将氨基甲酸乙酯的致癌等级由2B级提升到了2A级(与甲醛同级)。而黄酒中的氨基甲酸乙酯，已经成为危害消费者健康和影响其市场竞争力的重要隐患。

在清酒和黄酒中，由酿酒酵母代谢产生的尿素都是氨基甲酸乙酯最主要的前体物质。在发酵过程中，酵母细胞内的尿素主要由精氨酸代谢产生。当发酵培养基中无酵母偏好型氮源(谷氨酰胺、天冬酰胺等)存在时，尿素可以进一步被尿素水解酶降解为二氧化碳和氨。但当酵母偏好型氮源存在时，尿素水解酶的表达会受到强烈的抑制。这种现象由酿酒酵母的氮源阻遏效应(Nitrogencataboliterepression，简称NCR)调控，可以保证酵母细胞能在复杂的生存环境中优先利用最利于其生存的氮源。NCR效应的调控会导致酵母细胞内高浓度尿素的积累。由于尿素对酿酒酵母细胞有毒害作用，因此细胞通过尿素透性酶以主动运输的方式将尿素转运至胞外。在胞外的发酵液中，尿素可以在发酵的过程中自发的和乙醇反应形成氨基甲酸乙酯。

NCR效应相关的全局性调控因子主要有：四个GATA家族调控因子(Gln3p、Gat1p、Gzf3p和Dal80p)和Ure2p。其中Gln3p和Gat1p是正调控因子，Gzf3p和Dal80p是负调控因子，而Ure2p则是一个可以与Gln3p和Gat1p相结合的阻遏蛋白。在酿酒酵母中，Gln3p和Gat1p能否发挥其功能与它们在胞内的定位密切相关，只有当这两个激活因子被转运至细胞核内时，它们才能激活尿素代谢相关基因的表达。对这两个调控因子胞内定位的调控与它们蛋白序列上的核定位序列和核定位调控序列密切相关。Gln3p和Gat1p的核定位序列和核定位调控序列是酿酒酵母NCR效应重要的调控开关。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种通过改造酿酒酵母氮代谢物阻遏效应调控因子，提高酿酒酵母对非偏好型氮源利用的方法。

所述方法是对酵母的氮代谢物阻遏效应相关调控因子Gln3p和Gat1p进行改造。

所述改造是消除调控因子Gln3p和Gat1p的核定位调控序列并突变核定位序列上的磷酸化位点。

所述改造包括将氨基酸序列为SEQIDNO.1的Gln3p的位于654-667位氨基酸的核定位调控序列消除，并将第344位、第347位和第355位的丝氨酸突变为丙氨酸。

所述改造包括将氨基酸序列为SEQIDNO.2的Gat1p的位于376-510位氨基酸的核定位调控序列消除，并将第360位和第361位的丝氨酸突变为丙氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是：将改造后的Gln3p和Gat1p的基因片段先后连接到表达载体上得到重组质粒，然后将重组质粒转化到宿主酵母中进行表达。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体是pY26-GPD-TEF。

在本发明的一种实施方式中，所述pY26-GPD-TEF的核苷酸序列如SEQIDNO.25所示。

在本发明的一种实施方式中，所述酵母是酿酒酵母。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是：

(1)对Gln3p和Gat1p的核定位调控序列进行消除：将相应截短后的基因连接到表达载体pYX212，得到重组质粒pYX212-Gln3p_1-653和pYX212-Gat1p_1-375；

(2)对Gln3p和Gat1p的核定位序列上的磷酸化位点进行突变，指的是分别将质粒pYX212-Gln3p_1-653和pYX212-Gat1p_1-375上的GLN3和GAT1基因相应磷酸化位点基因突变，得到重组质粒pYX212-Gln3p_1-653,,S344A,s_347A,S355A和pYX212-Gat1p_1-375,S360A,s_361A；