[发明专利]一种制备胰凝乳蛋白酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说是灵活运用胰酶水解、丙酮沉淀、磷酸缓冲液盐溶、硫酸铵盐析等现代蛋白纯化技术，从合格的动物胰脏中制备胰凝乳蛋白酶的方法。

背景技术

胰凝乳蛋白酶chymotrypsin，是一种典型的丝氨酸蛋白酶，脊椎动物的消化酶。EC3.421.1。在胰脏中以酶前体物质胰凝乳蛋白酶原的形态生物合成，随胰液分泌出去。在小肠受到胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的一定的分解，转变成活性的胰凝乳蛋白酶。

胰凝乳蛋白酶经济价值极高，在医药方面主要作为治疗药物：（1）.用于创伤或手术后伤口愈合（2）抗炎及防止局部水肿、积血、扭伤血肿（3）乳房手术后浮肿、中耳炎、鼻炎等（4）本品对眼球睫状韧带有选择性松解作用，故可用于白内障摘除，使晶状体比较容易地移去。

药用的胰凝乳蛋白酶主要从牛胰脏中提取，而本发明是灵活运用胰酶水解、丙酮沉淀、磷酸缓冲液盐溶、硫酸铵盐析等现代蛋白纯化技术，使用磷酸盐、丙酮、硫酸铵等价格便宜的辅料，制备胰凝乳蛋白酶，不仅在一定程度上降低了成本，且产品的收率也能达到20万单位/kg胰脏。

发明内容

本发明的目的是从合格的动物胰脏中提取胰凝乳蛋白酶。

本发明的技术方案是：将合格的动物胰脏经过绞碎后，灵活运用胰酶水解、丙酮沉淀、磷酸缓冲液提纯及硫酸铵盐析结晶等现代蛋白纯化技术，制备胰凝乳蛋白酶的方法。本发明操作简单、成本低，非常适合于规模化大生产。包括如下步骤：

（1）水解：将新鲜或冷冻猪胰脏绞碎置于容器中，加入2~5倍量0℃以下的丙酮，在0℃左右搅拌脱水0.5~1.5小时，离心得沉淀物，加入0.5~1.5倍量的水及0.01~0.02倍量胰酶搅拌溶解，用6%~10%氢氧化钠溶液调至pH值至6.0~9.0，于15℃~25℃保温搅拌1~3小时，再加入硅藻土充分搅拌，过滤；

（2）沉淀：收集滤液与1.5~3倍量丙酮搅匀，静置10~14小时，虹吸弃去上层丙酮清液，用1.5~2倍量丙酮分3～4次洗涤沉淀物，过滤甩干，干燥，即得胰凝乳蛋白酶粗品；

（3）提纯：将粗品与45~60倍量磷酸缓冲液搅拌0.5~1.5小时，于15℃~25℃静置15~25小时，按照溶液的体积加入其量约3%~7%的硅藻土拌匀，过滤。往滤液中加入硫酸铵，至硫酸铵浓度达35%~45%。过滤，得盐析物；将盐析物再按1g:8~10ml的比例溶于碳酸缓冲液，然后在搅拌下逐滴加入饱和硫酸铵溶液，直至微浑，0℃~8℃下静置48~72小时，慢慢形成针状结晶，过滤；

（4）干燥：滤取晶体并用水冲洗3~5次，冷冻干燥，即可得胰凝乳蛋白酶。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

所述的利用胰酶水解、丙酮沉淀、磷酸缓冲液提纯及硫酸铵结晶等现代蛋白纯化技术，制备胰凝乳蛋白酶的方法，包括如下步骤：

1.水解：将新鲜猪胰脏绞碎置于容器中，加入3倍量0℃的丙酮，在0℃左右搅拌脱水1小时，离心得沉淀物，加入1倍量水及0.015倍量胰酶搅拌溶解，用8%氢氧化钠溶液调至pH值至7.5,于20℃保温搅拌2小时，再加入0.01倍量硅藻土充分搅拌，过滤。

2.沉淀：收集滤液与2倍量丙酮搅匀，静置12小时，虹吸弃去上层丙酮清液，用2倍量丙酮分4次洗涤沉淀物，过滤甩干，干燥，约得120g胰凝乳蛋白酶粗品。

3.提纯：将粗品与52倍量磷酸缓冲液搅拌混合1小时，于20℃静置20小时，加入其量约5%的硅藻土拌匀，过滤。往滤液中加入硫酸铵至浓度达40%，过滤，约得35g盐析物；将盐析物再按1g:10ml的比例溶于碳酸缓冲液，然后在搅拌下逐滴加入饱和硫酸铵溶液，直至微浑，4℃下静置72小时，慢慢形成针状结晶，过滤。

4.干燥：滤取晶体并用水冲洗3次，冷冻干燥，约可得4.5g胰凝乳蛋白酶。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。