[发明专利]一种山核桃RCA基因克隆的检测分析方法

权利要求书

1.一种山核桃RCA基因克隆的检测分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

a）序列检索与引物设计：通过克隆和比对确认山核桃存在2个RCA基因，利用β型RCA的ORF的序列作为查询标记在山核桃基因组中进行同源匹配，经同源基因序列比对和转录组序列分析，结合山核桃基因组片段检索，设计引物为Actin For：GCTGAACGGGAAATTGTCActin内参引物、Actin Rev：AGAGATGGCTGGCTGGAAGAGG Actin内参引物、Rca-abF：GACTTCGCCACTACGACCTG Rca基因部分片段扩取、Rca-adR：TTCTCCATACGACCATCACG Rca基因部分片段扩取、3’RACE-a：GAACCACCCAATACACTGTCAACAACCAA a亚基3端特异扩增、5’RACE-a：CCATCCATGTTGTTGTCCAGGTCGTAGTG a亚基5端特异扩增、3’RACE-b：GAACCACCCAATACACAGTCAACAACCAA b亚基3端特异扩增、5’RACE-b：CCATCCATGTTGTTGTCCAAGTTGTACTG b亚基5端特异扩增、qPCR-aF：GTGAAGAGGGTCCAACTTGCCGA a亚基定量、qPCR-aR：GCTCCCATCATCACTCCTCGCAG a亚基定量、qPCR-bF：GGCAAACAGACCGCCAAGGACA b亚基定量、qPCR-bR：TGGAAGAGCGAGTCAACCATACCC b亚基定量、Genome-aF：ACCTTCCATTAAAGTGCTGCGTGC a亚基基因组扩增、Genome-aR：CCAAGGGCAGCCTCGCTCAAGT a亚基基因组扩增、Genome-b1F：ACGAGGATGCTATTAAGAGCGGAAC b亚基基因组扩增、Genome-b1R：GAAGTTGGATCAAAGTTCTCTGGCA b亚基基因组扩增；

b）RCA基因中间片段扩增：根据同源序列结合已有山核桃转录组，利用PrimerPremier 5.0软件设计中间片段引物，并以β-Actin 作为内参基因，进行PCR扩增得到产物，经1%琼脂糖凝胶电泳可见550bp目的条带；

c）RCA基因3’端和5’端序列的扩增：根据中间片段测序结果分别设计α和βRACE引物，以3’端反转录cDNA为模板，3’端特异性引物和UPM（Universal Primer Mix）进行一次扩增得到产物，经1.5%琼脂糖凝胶电泳可见850 bp目的条带，同理，5’端特异性引物和UPM进行一次扩增得到产物，经1.5%琼脂糖凝胶电泳可见900 bp目的条带，由于α和β亚基中间片段序列相似度很高，所以特异性扩增引物相近，而RACE扩增产物大小几乎相同说明α和β亚基3端序列和3端不翻译区及5端序列和5端不翻译区长度相近，所有测序结果经拼接和比对获得α和β亚基cDNA全长；

d）CcRCAα与CcRCAβcDNA序列特性的分析：CcRCAα与CcRCAβ的cDNA全长相近，都包含完整的开放阅读框（ORF）和部分3端不翻译序列，预测编码472、435个氨基酸，理论相对分子质量51.52kD和47.52kD，BLAST分析显示两者相似85.44%，两条蛋白序列N端前55和57个氨基酸预测为叶绿体转运肽（cTP），那么CcRCAα与CcRCAβ成熟蛋白应包含417和378个氨基酸，相对应的分子质量为46.11kD和42.11kD，CcRCAα推导的蛋白序列在C端比CcRCAβ多出37个氨基酸，其中包含两个半胱氨酸残基是RCA氧化还原调节的关键位点，两段保守的ATP结合区域GGKGQGKS和LFIND分别位于氨基酸序列的162到170位和222到227位，根据对菠菜和烟草RCA的研究，在山核桃RCA中169位的赖氨酸与Rubisco活化和ATP酶活密切相关，227位的天冬氨酸对亚基结合过程中γ-磷酸键的精细调节必不可少，此外，CcRCAα编码的氨基酸比CcRCAβ在C端多37个，在已对比的序列中也有26个氨基酸种类差异，尽管未获得全部CcRCAα与CcRCAβ的不翻译序列，但已获得的序列存在明显区别，利用SignalP 4.1 Server程序对两蛋白质进行分析，没有发现信号肽，说明两蛋白质均非分泌蛋白；利用ChloroP 1.1Server程序预测蛋白质序列的叶绿体转运肽（cTP），结果表示，两基因蛋白质序列均含有叶绿体转运肽，且cTP前导序列长度分别为55和57，利用ExPASy的PSORT程序对蛋白亚细胞定位进行预测，结果表明RAC都定位在叶绿体中，通过TMpred程序预测蛋白质的跨膜结构域，结果显示，两蛋白具有2个跨膜螺旋，分别在氨基酸第88~107和143-162区域，说明CcRCA编码的蛋白可能是跨膜蛋白质，综合分析可知，CcRCA为细胞核基因编码，在叶绿体囊膜上发挥作用的酶蛋白；

e）RCA基因组序列分析：为了确认RCA和RCA是否来自同一条前体mRNA不同位置剪切，对山核桃基因组DNA进行分析，利用基因特异性引物扩取到CcRCAα、CcRCAβ的基因组DNA序列，CcRCAα基因组DNA包括6个内含子和7个外显子，长度分别为1590bp和1419bp；CcRCAβ包含5个内含子和6个外显子，长度分别为817bp和1308bp，利用DNAMAN软件进行多序列比对显示CcRCAα与CcRCAβ相似性较高，达到73.23%，与之前的mRNA的相似性比较结果一致，RCA基因组DNA的分析证实已发现的两种RCA mRNA分别由2个独立的基因编码而来，即1个α型基因和1个β型基因；

f）山核桃RCA的系统进化树分析：使用NCBI的blastx程序，对CcRCAα和 CcRCAβ基因进行蛋白同源性比对，发现山核桃与许多植物的RCA氨基酸序列都有较高的同源性，采用MEGA5.05软件的邻接法（Neighbor-Joining， NJ），构建山核桃CcRCAα和 CcRCAβ与美国山核桃等22种植物的RCA氨基酸序列的系统进化树，系统进化树显示，山核桃CcRCAα与美国山核桃（Caraya illinoensis）、美国红枫（Acer rubrum）苹果（Malus domestica）等的亲缘关系相近，CcRCAβ与葡萄（Vitis vinifera）、大豆（Glycine max）和棉花（Gossypium hirsutum）最为接近，相同度分别为88%、89%和88%，其中对其保守结构域分析发现，其保守区具有2个ATP结合位点P-环序列和ATPase sensor2 motif特殊位点，都属于ABC_ ATPaseSuperfamilies超家族基因，但均与云杉（Picea sitchensis）、衣藻等的亲缘关系较远；

g）不同生长时期山核桃叶片中RCA表达分析:每隔一周于午后取同株不同枝头最外侧幼叶或叶片进行编号后，迅速液氮冷冻处理，置于-70℃冰箱保存，采用改良的CTAB法与TaRaKa公司生产的 MiniBEST UniversalRNA Extraction Kit试剂盒联合使用提取不同生长时期叶片的总RNA，以提取所得总RNA为模板，OligodT为引物，按照TaRaKa公司生产的Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）试剂盒操作说明书合成cDNA第一链，稀释5倍后用以RT-qPCR检测基因的相对表达量，自然条件下生长的山核桃叶在不同时期RCA的表达量，随着生长日期变化，CcRCAα和CcRCAβ基因表达趋势相近。

2.如权利要求1所述一种山核桃RCA基因克隆的检测分析方法，其特征在于：所述步骤d、步骤e、步骤f、步骤g中的CcRCAα指的是采用3’/5’RACE和RT-PCR技术成功扩增出山核桃2个RCA基因的3’端，序列拼接分别获得全长cDNA序列；所述步骤d、步骤e、步骤f、步骤g中的CcRCAβ指的是采用3’/5’RACE和RT-PCR技术成功扩增出山核桃2个RCA基因的5’端，序列拼接分别获得全长cDNA序列。