[发明专利]一种山核桃RCA基因克隆的检测分析方法

说明书

本发明公开了一种山核桃RCA基因克隆的检测分析方法，其特征在于:包括以下步骤；a)序列检索与引物设计、b)RCA基因中间片段扩增、c)RCA基因3’端和5’端序列的扩增、d)CcRCAα与CcRCAβcDNA序列特性的分析、e)RCA基因组序列分析、f)山核桃RCA的系统进化树分析、g)不同生长时期山核桃叶片中RCA表达分析，本发明利用RACE和RT‑PCR技术，克隆获得山核桃2个RCA基因全长，结合生物信息学分析，分析了在碱基序列、编码氨基酸序列及其他特性差异，并通过不同发育时期叶片的RCA基因表达情况探求RCA基因的表达模式，为利用基因工程手段调控RCA以增加光合速率和提高抗逆性打下基础。

【技术领域】

本发明涉及生物工程的技术领域，特别是一种山核桃RCA基因克隆的检测分析方法的技术领域。

【背景技术】

山核桃属胡桃科山核桃属植物，约有20个种，其中4个种原产中国，原产欧洲东南部及亚洲西部汉代传入中国，经数百年的繁育国内品种已经和国外的完全不同了。世界上基本亚热带地区都有胡桃科植物分布，品种数百种。国内各地都有分布，东北以秋子居多(野生)华北，西北也有分布。

山核桃在进行光合作用时，关键步骤固定CO2过程需要Rubisco酶的催化。Rubisco酶的活性由植物体内复杂的机制进行调控，其中大量研究已证实Rubisco activase(RCA)能够活化并维持Rubisco酶的催化活性。同时RCA也被认为是植物在各种不同环境胁迫下对光合作用的关键调控因素，Mate等发现植物表达低水平的RCA会导致氮素积累和总生物量的减少，同时RCA表达很少或不表达的个体则无法在大气二氧化碳浓度下存活。因此，相关研究通过RCA调控提高CO2吸收率最终提高作物产量具有重要意义。

【发明内容】

本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种山核桃RCA基因克隆的检测分析方法，本发明利用RACE和RT-PCR技术，克隆获得山核桃2个RCA基因全长，结合生物信息学分析，分析了在碱基序列、编码氨基酸序列及其他特性差异，并通过不同发育时期叶片的RCA基因表达情况探求RCA基因的表达模式，为利用基因工程手段调控RCA以增加光合速率和提高抗逆性打下基础。

为实现上述目的，本发明一种山核桃RCA基因克隆的检测分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)序列检索与引物设计：通过克隆和比对确认山核桃存在2个RCA基因，利用β型RCA的ORF的序列作为查询标记在山核桃基因组中进行同源匹配，经同源基因序列比对和转录组序列分析，结合山核桃基因组片段检索，设计引物为Actin For：GCTGAACGGGAAATTGTCActin内参引物、Actin Rev：AGAGATGGCTGGCTGGAAGAGG Actin内参引物、Rca-abF:GACTTCGCCACTACGACCTG Rca基因部分片段扩取、Rca-adR：TTCTCCATACGACCATCACG Rca基因部分片段扩取、3’RACE-a:GAACCACCCAATACACTGTCAACAACCAA a亚基3端特异扩增、5’RACE-a：CCATCCATGTTGTTGTCCAGGTCGTAGTG a亚基5端特异扩增、3’RACE-b：GAACCACCCAATACACAGTCAACAACCAA b亚基3端特异扩增、5’RACE-b：CCATCCATGTTGTTGTCCAAGTTGTACTG b亚基5端特异扩增、qPCR-aF:GTGAAGAGGGTCCAACTTGCCGA a亚基定量、qPCR-aR：GCTCCCATCATCACTCCTCGCAG a亚基定量、qPCR-bF：GGCAAACAGACCGCCAAGGACA b亚基定量、qPCR-bR：TGGAAGAGCGAGTCAACCATACCC b亚基定量、Genome-aF:ACCTTCCATTAAAGTGCTGCGTGC a亚基基因组扩增、Genome-aR：CCAAGGGCAGCCTCGCTCAAGT a亚基基因组扩增、Genome-b1F:ACGAGGATGCTATTAAGAGCGGAAC b亚基基因组扩增、Genome-b1R:GAAGTTGGATCAAAGTTCTCTGGCA b亚基基因组扩增；