[发明专利]一种结核分枝杆菌检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及结核分枝杆菌的检测，具体涉及一种结核分枝杆菌检测试剂盒及其应 用。

背景技术

结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)是引起结核病(tuberculosis)的 病原体，可侵犯人体全身各器官，其中以肺结核最为多见。结核病是全世界面临的最大公共 卫生问题，据世界卫生组织报道，全球每年约有800万新发结核病患者，并且至少有300万人 死于该病。中国是世界结核病负担最重的国家之一，并且发病速度下降非常缓慢，疫情主要 集中在经济相对不发达的西部地区以及农村地区。

作为呼吸道传染性疾病，结核分枝杆菌主要通过空气飞沫进行传播。据文献报道， 1名结核病患者能够传染10名以上的普通人感染结核，特别是近年来，在学生及流动人口等 人员相对密集的人群中，每年多次发生聚集性疫情。因此，如何快速并且准确地对结核分枝 杆菌进行检测，对于及时发现传染源、及早开展有效地抗结核治疗以及控制结核病在人群 中的传播和蔓延具有重要意义。

传统的结核分枝杆菌检测方法主要包括涂片和培养等细菌学检测方法。涂片法虽 然检测时间较短，然而灵敏度较低，通常要求待测样本中结核分枝杆菌含量高于1000个/ mL，此外特异性较差，特别是无法区分样本中结核分枝杆菌的存活状态，因此易造成假阳 性；培养法的灵敏度和特异性较高于涂片法，其能区分标本中结核分枝杆菌的存活状态，然 而由于结核分枝杆菌细胞壁较厚且生长周期较长，培养时间通常需要4-8周，因此不利于实 际的临床应用。

目前，已有研究将多聚酶链反应(PCR)扩增技术应用于结核分枝杆菌DNA的鉴定， 该方法主要针对的是样本中核酸的存在与否以及拷贝数，其虽具有灵敏度高、快速等优 点，然而无法区分样本中的死菌和活菌这一缺陷导致检测假阳性率较高，此外引物和探针 的设计对于检测结果的准确性和特性异至关重要。

发明内容

本发明提供一种结核分枝杆菌检测试剂盒及其应用，用于解决现有技术中的结核 分枝杆菌检测方法灵敏度和特异性低、假阳性率高等技术缺陷。

本发明提供一种结核分枝杆菌检测试剂盒，包括：

上游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；

下游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；

探针，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，并且在探针的5’端标记荧光基团，在探 针的3’端标记淬灭基团。

在本发明中，所述荧光基团和淬灭基团可以为本领域的常规基团，例如所述荧光 基团可以为FAM，所述淬灭基团可以为MGB。

进一步地，所述上游引物、下游引物和探针可以常规浓度单独存在试剂盒中，例如 上游引物的浓度可以为5-20μM，下游引物的浓度可以为5-20μM，探针的浓度可以为1-10μM。

本发明的结核分枝杆菌检测试剂盒还可以包括光敏DNA染料；进一步地，光敏DNA 染料可以5-20mg/mL的浓度单独存在于试剂盒中。光敏DNA染料是对DNA具有高度亲和力的 光敏染料，例如可以为叠氮溴化乙锭(EMA)、叠氮溴化丙啶(PMA)等，其能选择性地进入细胞 壁和细胞膜受损的死细胞中，通过光活化反应(例如光照处理)与死细胞中的DNA共价结合， 从而阻断死细胞DNA后续的PCR扩增；此外，由于活细胞的细胞壁和细胞膜相对完整，该类染 料无法进入活细胞中，从而不会影响活细胞DNA后续的PCR扩增。在本发明的试剂盒中设置 上述光敏DNA染料有利于提高结核分枝杆菌检测的特异性和准确性，避免造成假阳性。

本发明的结核分枝杆菌检测试剂盒还可以包括实施荧光定量PCR所必要的其它试 剂，例如稀释液、裂解液、PCR混合液等，其均可以为本领域的常规试剂。其中，稀释液用于进 行稀释，其可以为PBS缓冲液等；裂解液用于提取样本DNA，其可以为本领域常规提取方法所 用的裂解液，包括但不限于CTAB法、酚/氯仿法、ChelexlOO法等；PCR混合液用于实施荧光 定量PCR，其可以包括本领域常规的PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、镁离子等。