[发明专利]一种高产神经酰胺基因工程海洋球石藻株的构建方法

权利要求书

1.一种高产神经酰胺基因工程海洋球石藻株的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、PCR扩增EhV99B1丝氨酸棕榈酰转移酶：

采用CTAB法提取海洋球石藻病毒EhV99B1基因组，PCR扩增所用引物为：SEQ ID NO.1：SPT-F:5’-AAGCTTATGTACACGGCCGTATTCA-3’；SEQ ID NO.2：SPT-R：5’-AAGCTTCTATGACAGATACTCAATCATAA-3’；

步骤二、重组质粒pMD19-T-SPT的制备：

PCR电泳产物经DNA回收试剂盒回收后，进行T-A克隆，所用载体为pMD19-T，并转化到大肠杆菌Top10感受态细胞；

步骤三、重组子pEhux-SPT的制备：

重组质粒pMD19-T-SPT以Hind III单酶切获得2613bp的目的基因片段，与经Hind III单酶切的载体pEhux-I连接，并转化大肠杆菌Top10，筛选得到重组子pEhux-SPT，其中，pEhux-I质粒图谱为：

步骤四、pEhux-SPT转化球石藻细胞：

采用电击转化法将重组质粒pEhux-SPT与质粒pEhux-II共转化球石藻细胞，于含1.5％琼脂的F/50固体培养基中添加终浓度为50ug/ml的草铵膦作为固体选择性培养基进行转化子的筛选，然后转入不含琼脂的液体选择性培养基中培养8-12天，收集藻细胞，经PCR验证获得含有病毒SPT基因的球石藻基因工程藻株。

2.如权利要求1所述的一种高产神经酰胺基因工程海洋球石藻株的构建方法，其特征在于：所述步骤一中，所述PCR扩增反应体系为25μl，含1μl模板DNA、0.5μl GXL DNA Polymerase、1μl上游引物SEQ ID NO.110pmol/μl、1μl下游引物SEQ ID NO.210pmol/μl，2μl dNTP、5μl5×GXL缓冲液，14.5μl无菌水；PCR的反应条件为：98℃10s，60℃15s，68℃1min，循环30次后加入rTaq DNA聚合酶及10×PCR buffer72℃延伸10min，保存于4℃。

3.如权利要求1所述的一种高产神经酰胺基因工程海洋球石藻株的构建方法，其特征在于：所述步骤二中，将10μl连接产物，所述连接产物含有4μL回收的SPT基因、1μl pMD19-T载体和5μl solutionI连接酶，加入到200μl的大肠杆菌Top10感受态细胞，置冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min；再加入到含有800μl LB培养基的试管中，37℃，150rpm，培养60min；取200μl培养液涂布至Amp板，Amp浓度为10mg/ml，37℃倒置培养过夜，至克隆长出，进行蓝白斑筛选；挑取白色菌落，采用试剂盒小量提取质粒。