[发明专利]一种高产神经酰胺基因工程海洋球石藻株的构建方法

说明书

本发明公开了一种高产神经酰胺基因工程海洋球石藻株的构建方法，包括以下步骤：步骤一、PCR扩增海洋球石藻病毒EhV99B1丝氨酸棕榈酰转移酶；步骤二、重组质粒pMD19‑T‑SPT的制备：PCR电泳产物经DNA回收试剂盒回收后，进行T‑A克隆，所用载体为pMD19‑T，并转化到大肠杆菌Top10感受态细胞；步骤三、重组子pEhux‑SPT的制备：重组质粒pMD19‑T‑SPT以Hind III单酶切获得2613bp的目的基因片段，与经Hind III单酶切的载体pEhux‑I连接，并转化大肠杆菌Top10，筛选得到重组子pEhux‑SPT；步骤四、pEhux‑SPT转化球石藻细胞：采用电击转化法将重组质粒pEhux‑SPT与质粒pEhux‑II共转化球石藻BOF92细胞。本发明构建的基因工程海洋球石藻株，通过病毒SPT基因的过表达从而有效提高了藻细胞中神经酰胺的含量。

技术领域

本发明涉及一种海洋微型浮游植物，尤其是涉及一种高产神经酰胺的基因工程海洋球石藻(Emiliania huxleyi)株的构建方法。

背景技术

近年来，微藻基因工程研究取得了许多重要进展，在微藻产品高值化上具有广泛的应用前景。目前，利用基因工程手段将外源基因转入到微藻细胞中已经有所报道，通过对藻类基因工程的研究，可以从改造的藻体中筛选抗性强且生长快的优良藻种，并把藻类作为新型的生物反应器生产某些具有较大经济价值的生物活性物质。在微藻中表达重要的蛋白、多肽甚至次生产物合成酶系，通过分子生物学技术阻断或修饰代谢途径，以创造具有商业价值的工程藻株和开发高价值微藻产品，推动微藻生物技术产业发展。

目前用于转化藻类的常用方法有：

①玻璃珠法，在待转化的藻细胞样品中加入DNA、玻璃珠和聚乙二醇，短暂涡旋震荡，使细胞产生瞬时空洞，从而使得DNA进入细胞内。该方法的优点是不需要昂贵的专业设备、操作简单、重复性好，缺点是需要使用没有细胞壁的藻株或者制备原生质体。由于微藻细胞壁结构组成的复杂性和多样性，大部分藻株很难获得可存活的原生质体，因此玻璃珠法并不适合用于所有微藻的转化。

②农杆菌侵染法，农杆菌是一种土壤寄生菌，具有感染植物细胞的能力。研究表明，该方法也可以用于真核微藻的转化，具有可以转化有完整细胞壁的微藻细胞T-DNA准确插入宿主基因组中、获得稳定转化子的效率较高等优点。

③基因枪法，将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下，微粒被高速射入受体细胞，微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到染色体上，得到表达，从而实现基因的转化。该方法具有可以同时穿透细胞质膜和细胞器膜，几乎可以用于转化所有的微藻等优点，但是存在设备要求高、价格昂贵等缺点。

④电击法，在适当的外加电场强度和脉冲时间作用下，细胞膜产生瞬间的可逆性小孔，使附着在质膜上的DNA分子进入细胞内，移去外加电压后，膜孔在一定时间内可以自动修复，不影响或很少影响细胞质的生命活动，从而达到转化的效果。该方法的优点有强度适当的电脉冲对DNA和受体细胞损害较小、操作容易控制、流程简单、没有细胞的种属限制、转化效率较高等。其中比较常用是基因枪法和电转化法。通过现代生物技术(如基因工程、发酵工程及酶工程等)强化活性物质代谢途径，提高其产量已成为海洋生物资源领域新的研究热点。

神经酰胺(Ceramide)是一种新型的生物活性物质，对细胞分化、增殖、免疫、凋亡、衰老等生命活动具有重要调节作用；其特有的生理功效使其成为一种附加值高和市场潜力大的活性成分，在医药、食品、化工特别是高档护肤品以及治疗某些皮肤病的药物开发中具有广阔的应用前景。神经酰胺在生物体中以信号传导分子的形式存在，通常含量极低，一般低于细胞总脂类的1％，目前制备神经酰胺的原料主要为玉米、小麦、魔芋、米糠，但生产成本高，价格昂贵，产量不高。天然神经酰胺产量较低是制约神经酰胺功能性产品开发的瓶颈，迫切需要找到一种安全经济的来源和提高神经酰胺产量的途径。