[发明专利]一种基于荧光共振能量转移技术的白三烯B4受体1拮抗剂药物筛选模型

权利要求书

1.白三烯受体BLT₁拮抗剂药物筛选模型，其特征在于，包括步骤：

(1)白三烯受体BLT₁拮抗剂筛选模型的建立与优化；

(2)阳性药验证模型可靠性；

(3)高通量筛选模型验证。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中T25中培养的细胞贴壁度要达到80％，达到对数生长期，细胞密度为3×10⁶cells/mL。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)确定细胞数、验证阳性药及筛选BLT₁拮抗剂试验的CHO-K1细胞应是复苏后至少传代3次且达到稳定生长状态的细胞。于实验前将其用PBS润洗细胞一次，接着用0.5mMEDTA消化，离心，去除上层液体，最后将细胞用适量SB重悬至所需细胞密度。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)配置IP-one标准稀释液、激动剂LTB₄梯度稀释液需按照给定浓度配置，细胞分别稀释15000cells/μL、20000cells/μL、25000cells/μL。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)加样方法：a：将稀释好的IPl溶液加入384白板中，每孔14μl，三个复孔；b：将稀释好的LTB₄溶液按每个浓度3个复孔，7μl每孔加入384孔板中，接着向其中分别加入配制好的不同浓度的细胞稀释液7μl。此时标准曲线和反应孔反应体积均为14μl。将TopSeal-A膜贴于板面并37℃孵育1h。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)终止试剂配置：用Lysisbuffer(LB)将IP1-d2及anti-IP1稀释33倍，按1∶1混匀平衡室温后加入各孔，每孔6μL。将384孔板在500rpm下离心5s，使20μL试剂混合均匀以充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室温下继续孵育1h。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)配制BLT₁拮抗剂LY293111梯度稀释液方法为：拮抗剂LY293111母液浓度为4.6mM，用IP1StimulationBuffer逐级稀释为终浓度的5倍。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)加样方法：将稀释好的LY293111溶液按每个浓度3个复孔，3.5μL每孔加入384孔板中。将配制的细胞溶液按每孔7μL加入384孔板中。将384孔板在500rpm下离心5s，使10.5μL试剂混合均匀以充分反应。为防止试剂蒸发造成损失，将TopSeal-A膜贴于板面并将板放于室温下使之孵育30min。将LTB₄母液稀释成步骤(2)中测定的EC₈₀，每孔3.5μl加入对应的含塔索罗辛的384孔板中。将384孔板在500rpm下离心5s，使14μL试剂混合均匀以充分反应。为防止试剂蒸发造成损失，将TopSeal-A膜贴于板面并将板放于37℃/5％CO₂下使之孵育45min。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)按步骤(2)配制终止试剂。向每孔加入6μLIP1-d2/anti-IP1溶液(1∶1)。将384孔板在500rpm下离心5s，使20μL试剂混合均匀以充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室温下继续孵育1h。

10.权利要求1-10中所述任一所述的方法在筛选白三烯受体BLT₁拮抗剂药物的应用。