[发明专利]一种基于荧光共振能量转移技术的白三烯B4受体1拮抗剂药物筛选模型

说明书

技术领域

本发明属于药理学领域，利用细胞稳定转染和均相时间分辨荧光检测技术，构建了白三烯B4受体1拮抗剂药物的筛选模型，用于待测样品对BLT₁的拮抗作用的高通量检测。

背景技术

白三烯B4受体1(BLT₁)是一种G蛋白偶联受体，在花生四烯酸代谢途径中发挥着重要作用。白三烯(LT)通过激活BLT₁在支气管哮喘、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化及多发性硬化等疾病进程中发挥着重要的作用。

IP3是一种重要的第二信使，介导胞内Ca²⁺通道开放，增加胞内Ca²⁺浓度，引起生理反应。胞内IP3是PIP2经PKC催化产生，PKC可在GPCRs与GTP结合蛋白Gαq相互作用后而激活。这些G蛋白是由Gα，Gβ和Gγ三种亚基组成的异三聚体分子。激动剂介导的GPCRs激活可导致GTP结合上Gα亚基，引起构象改变，导致三聚体解离成Gα和Gβγ。解离后，Gαq参与PKC的激活。IP3不稳定，在胞内逐步降解为IP2、IP1。IP1在LiCl存在下可稳定存在。测量胞内IP1是检测待测化合物对于GPCRs介导的PKC激活作用的方法。

IP1assay是一种均相时间分辨荧光共振能量转移免疫分析方法，以检测在GPCRs调控下PKC活性变化后产生的IP1。该方法基于d2标记的IP1示踪剂与样本IP1竞争结合Eu³⁺-穴状物标记的IP1特异性抗体的结合位点。当抗体结合了d2-IP1示踪剂，337nm处的激光可激发Eu³⁺-穴状物分子，其发出的能量被转移到示踪剂的d2分子上，而发出665nm的荧光，在665nm处的荧光强度随着待测样品中的IP1含量的增多而减弱，因此信号强度与样品中IP1浓度成反比。对于Gαq耦联的受体，细胞受到激动剂作用而激活会导致IP1水平增加，同时665nm处的荧光强度减弱。加入拮抗剂后该反应逆转，导致信号增强。

发明内容

本发明的目的在于建立稳转细胞株白三烯受体BLT₁拮抗剂高通量筛选模型，具有灵敏度高、步骤少、无损失、结果准确的特点。

本发明的技术方案：确定稳转细胞株白三烯受体BLT₁拮抗剂药物筛选模型构建条件，运用IP1assay免疫分析法验证激动剂对稳转细胞株BLT₁受体的激动作用，以及拮抗剂对稳转细胞株BLT₁受体的拮抗作用。

步骤一：白三烯受体BLT₁拮抗剂筛选模型的建立与优化。

步骤二：阳性药验证模型可靠性。

步骤三：高通量筛选模型验证。

附图说明：

图1：IP1标准稀释液在Paradigm中的读值。(n＝3，)

图2：LTB4作用激动BLT₁稳转细胞产生的量效曲线。(n＝3，)

图3：LY293111拮抗BLT₁稳转细胞产生的量效曲线。(n＝3，)

具体实施方式

以下结合附图说明本发明的具体实施方式：

一、白三烯受体BLT₁拮抗剂筛选模型的建立

1、实验材料

CHO-K1/Gal5/BLT1细胞株、F12、10％FBS、2μL/mLHygromycin、StimulationBuffer(SB)、CO₂培养箱、384孔板、Paradigm^TMDetectionPlatform。

2、实验步骤

(1)细胞培养

1)T25中培养的细胞贴壁度要达到80％，达到对数生长期。

2)将贴壁细胞经EDTA消化、离心后重悬，对细胞计数。

3)用培养基稀释细胞悬液，使细胞密度达到3×10⁶cells/mL，将此细胞悬液移入T25培养瓶中，在37℃/5％CO₂环境下培养细胞。

4)用于确定细胞数、验证阳性药及筛选BLT₁拮抗剂试验的CHO-K1细胞应是复苏后至少传代3次且达到稳定生长状态的细胞。于实验前将其用PBS润洗细胞一次，接着用0.5mMEDTA消化，离心，去除上层液体，最后将细胞用适量SB重悬至所需细胞密度。

(2)标准曲线的测定及最佳细胞数确定