[发明专利]一种基于荧光共振能量转移技术的血管活性肠肽I型受体抑制剂高通量筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于药理学领域，利用荧光检测技术，构建了血管活性肠肽I型受体抑制剂的高通量筛选模型，用于待测样品对血管活性肠肽I型受体抑制活性的高通量检测。

技术背景

血管活性肠肽I型受体是神经多肽与血管活性肠肽的共同受体，介导多种重要的生物学功能，如血管活性肠肽I型受体介导神经多肽与血管活性肠肽抑制食欲和抗炎的生物学功能。血管活性肠肽I型受体在大脑和T细胞大量表达，能够调节神经元分化和T细胞活化。血管活性肠肽I型受体作为血管活性肠肽受体其中一种亚型，在多种肿瘤细胞表面高水平表达，而低表达或不表达于正常组织细胞，并在肿瘤的进展和血管生成中发挥重要作用，是一具潜在应用价值的分子影像诊断和治疗靶标，所以筛选血管活性肠肽I型受体拮抗剂具有重要应用价值。

时间分辨荧光技术(time-resolvedfluorescence，TRF)是基于镧系元素如铕(Eu)、钐(Sm)、镝(Dy)等具有较长荧光寿命的特点发展而来的。当铕螯合物供体与受体之间距离小于10nm，且供体发射光谱与受体激发光谱有重叠时，则发生荧光共振能量转移，均相时间分辨荧光(homogeneoustime-resolvedfluorescence，HTRF)技术是法国Cisbio公司利用这一原理进行深入开发的产品。大多数荧光物质的荧光寿命非常短(一般为几毫秒)，为了避免短暂的荧光干扰，Cisbio公司利用较长荧光寿命的镧系螯合物作为荧光能量供体，受体经过别藻蓝蛋白(allophycocyanin)或荧光素修饰，供体在能量转移时就可以使受体也具有较长的荧光寿命。因此，能量转移时受体发射光消失时间与供体发射光消失时间成正比，而与供受体间的距离成反比，这种方法延长了荧光检测时间，降低了短暂荧光引起的背景干扰。

实验中利用血管活性肠肽I型受体和Gs蛋白耦联，激活AC，使cAMP含量增加，会产生带有荧光的产物，通过荧光强弱来判断血管活性肠肽I型受体的作用，从而得出化合物是否有抑制血管活性肠肽I型受体作用，可以实现对血管活性肠肽I型受体抑制剂的高通量筛选模型的建立。

目前，少有对于血管活性肠肽I型受体抑制剂的筛选方法，因此，建立方便快捷准确的检测方法，特别是体外的功能性检测在药物筛选中越来越受到重视。

发明内容

本发明的目的在于建立一种基于荧光的血管活性肠肽I型受体抑制剂高通量筛选模型，具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。

本发明的技术方案：采用荧光方法建立体外血管活性肠肽I型受体抑制剂高通量筛选模型，初筛，复筛发现一类具有抑制血管活性肠肽I型受体活性的候选化合物。具体步骤如下：

本发明利用荧光的方法建立了一种血管活性肠肽I型受体抑制剂高通量筛选模型。

步骤一：血管活性肠肽I型受体抑制剂筛选模型的建立与优化。

步骤二：阳性药验证模型可靠性。

步骤三：高通量筛选模型验证。

附图说明：

图1：血管活性肠肽I型受体细胞浓度梯度优化实验结果。(n＝1，)

图2：VIP浓度梯度优化实验结果。(n＝1，)

图3：阳性药VIP(1-7)-GRF(8-27)对血管活性肠肽I型受体的抑制曲线图。

具体实施方式

以下结合附图说明本发明的具体实施方式：

一、血管活性肠肽I型受体抑制剂筛选方法建立

1、实验材料

d2-cAMP检测试剂盒(Cisbio，法国)、VIP(Sigma-aldrich，美国)、VIP(1-7)-GRF(8-27)(Sigma-aldrich，美国)、DMEM、FBS(Gibco，美国)384孔聚丙烯微孔板Cat#3573(Corning，美国)、一次性枪头(Axygen，美国)

2、实验步骤

1)血管活性肠肽I型受体细胞最适浓度确定

1)配制不同浓度的血管活性肠肽I型受体细胞，每孔加入5μl。

2)每孔加入5μl含VIP的1×反应buffer。

4)室温反应45分钟。

5)加入10μl×终止buffer，室温孵育1小时。检测荧光强度，确定最适血管活性肠肽I型受体细胞浓度(见图2)。

(2)VIP最适浓度确定