[发明专利]一种能高效表达脂肪酶的质粒、其构建方法及其应用

权利要求书

1.一种能高效表达脂肪酶的质粒pHP13L，其特征在于，其包括以下结构部分：

A.PAs基因表达盒，由噬菌体φ29的A1启动子a1以及枯草芽孢杆菌(B.subtilis)aprE基因的稳定子a2构成；

B.编码枯草芽孢杆菌脂肪酶LipA的基因lip的编码区；

C.质粒pHP13；

其中A、B、C三个结构部分之间的结构关系为A与B拼接为AB，然后将AB插入C中；

所述噬菌体φ29的A1启动子a1的碱基序列如SEQ ID No.1所示；所述枯草芽孢杆菌(B.subtilis)aprE基因的稳定子a2的碱基序列如SEQ ID No.2所示；所述结构部分B的碱基序列如SEQ ID No.3所示；所述结构部分C的碱基序列如SEQ ID No.4所示；其中所述a1与所述a2的结构关系为a1位于a2的上游；所述A与所述B的位置关系为A位于B的上游；所述AB在所述a1上游的酶切位点Pst I和所述B下游的酶切位点EcoR I之间插入C。

2.一种根据权利要求1所述的质粒pHP13L的构建方法，其特征在于，其包括以下步骤：

a.首先将所述噬菌体φ29的A1启动子a1与所述枯草芽孢杆菌(B.subtilis)aprE基因的稳定子a2拼接，得到结构部分A；然后将所述结构部分A与所述结构部分B拼接得到所述AB；

b.通过设计引物P1和P2在a1的上游添加酶切位点Pst I，在B的下游添加酶切位点EcoRI，然后通过PCR扩增，获得带有酶切位点的已修饰的编码枯草芽孢杆菌脂肪酶LipA的基因lip片段，PCR产物即为带有酶切位点的AB；

c.将所述带有酶切位点的AB和C分别用限制性核酸内切酶进行双酶切并进行纯化；

d.通过DNA连接酶的作用，将经双酶切后的包含AB的基因片段与经双酶切后的C连接，即得到构建好的所述质粒pHP13L，其碱基序列如SEQ ID No.5所示；

其中所述引物P1和P2的序列如下：

P1：5’-AAAACTGCAGTTCTGAACCGACTTCTCCTT-3’

P2：5’-CCGGAATTCCCATTGTCCGTTACCTGATAG-3’

所述限制性核酸内切酶识别位点以加下划线的碱基表示。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，其各步骤中具体工艺条件如下:

步骤b的工艺条件如下：

(1)PCR反应体系

其中所述“10×全式HiFi DNA聚合酶缓冲液”表示的含义为：所用所述全式HiFi DNA聚合酶缓冲液的浓度为其工作浓度的10倍，所述工作浓度指的是DNA聚合酶能够正常催化反应的浓度；

(2)PCR反应条件

步骤c的工艺条件如下：

(1)双酶切反应体系

其中，所述“2×缓冲液O”表示的含义为：所用所述缓冲液O的浓度为其工作浓度的2倍，所述工作浓度指的是两种限制性核酸内切酶能够正常催化反应的浓度；其中所述缓冲液O购自ThermoFisher公司，“O”代表缓冲液的型号；

(2)DNA纯化

DNA纯化采用多功能DNA纯化回收试剂盒对得到的双酶切产物进行纯化以去除干扰的杂片段；

步骤d的工艺条件如下：步骤d反应体系

4.一种包含根据权利要求1所述的质粒pHP13L的细菌，其保藏编号为CGMCC No.11522。

5.根据权利要求4所述的细菌的构建方法，其特征在于，其包括以下步骤：

a.将重组质粒pHP13L转化进入枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中，得到重组细胞，用含氯霉素的LB平板筛选所述重组细胞；

b.将得到的筛选后的重组细胞涂布于中性红油脂平板上划线，于37℃环境下培养24小时，得到深红色的菌株，即为所述重组质粒正确表达的转化子；其中所述中性红油脂平板是在LB培养基的基础上，添加0.2％的质量浓度为1.6％的中性红溶液和2％的花生油。