[发明专利]一种能高效表达脂肪酶的质粒、其构建方法及其应用

说明书

本发明涉及一种能高效表达脂肪酶的质粒pHP13L，包含所述质粒pHP13L的细菌的保藏编号为CGMCC No.11522,其包括以下结构部分：A.PAs基因表达盒，由噬菌体φ29的A1启动子a1以及枯草芽孢杆菌(B.subtilis)aprE基因的稳定子a2构成；B.编码枯草芽孢杆菌脂肪酶LipA的基因lip的编码区；C.质粒pHP13；其中A、B、C三个结构部分之间的结构关系为A与B拼接为AB，然后将AB插入C中。本发明还涉及所述质粒pHP13L的构建方法、包含所述质粒pHP13L的细菌(其保藏编号为CGMCC No.11522)以及上述细菌的构建方法。本发明的重组细菌可以用于食品生产、养殖、饲料生产以及脂肪酶生产等领域。

技术领域

本发明涉及一种能高效表达脂肪酶的质粒、其构建方法及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3)，全称为三酰基甘油水解酶，是一类能将长链脂肪酸甘油酯水解成脂肪酸和二酰甘油酯、单酰甘油酯和甘油的生物酶。脂肪酶除了能够催化脂肪水解反应，还能够催化酯交换反应、酯化反应、脂肪的酸解反应和醇解反应。脂肪酶的催化反应主要发生在油水界面，具有独特的界面活化特性。羧酸酯酶(EC 3.1.1.1)也是催化酯水解反应的酶，无界面活化特性，仅作用于水溶性底物，且底物是由短链脂肪酸(≤C8)形成的酯。为了区别不同的酯水解酶，脂肪酶也称为纯脂肪酶(True lipase)。在动植物和微生物细胞中，脂肪酶广泛存在。其中微生物来源的脂肪酶具有底物广泛、酶活性高、稳定性好、易于工业化生产等特性，在食品、造纸、皮革、化妆品、制药等许多工业领域都有广泛的应用。

枯草芽孢杆菌(B.subtilis)脂肪酶(LipA)属于第4亚族，分子量约为19.3kD，是已知3个分子量最小的脂肪酶之一；由于B.subtilis脂肪酶没有“盖子”结构，而缺少界面活化特性，使其在极性和非极性介质中都能发挥催化作用，而且底物范围较广、稳定性好、能够适应碱性条件(pH9.5)。

B.subtilis不分泌外毒素、安全性高、易于基因调控、无密码子偏向性、生长快、易于大规模培养、且能够直接分泌胞外蛋白到培养基中，因此被视为优良的蛋白表达系统。目前利用B.subtilis表达微生物脂肪酶的研究主要集中于脂肪酶表达元件的修饰替换和载体及蛋白质信号肽的筛选。表达元件的修饰替换一般是将lip基因的启动子替换为强启动子以及将稳定子替换为强稳定子。

Lesuisse等将lip基因与表达质粒连接，构建了重组质粒pMA5-lip，然后将其转入B.subtilis BCL1050，发酵液最高脂肪酶活性为7.5U/mL。Ma等向质粒pBD64中插入一个强启动子和终止子，然后再将脂肪酶基因插入其中，转入B.subtilis A.S.1.1655后，构建了能表达脂肪酶的重组菌BSL2，其脂肪酶活力相比野生型菌株IFFI 10210提高了将近100倍，发酵液最高酶活为0.012U/mL。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能高效表达脂肪酶的质粒及其构建方法，本发明的目的还在于提供一种包含上述质粒的高产脂肪酶的重组枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

本发明第一方面涉及一种能高效表达脂肪酶的质粒pHP13L，包含所述质粒pHP13L的细菌菌株为枯草芽孢杆菌，该菌株已于2015年10月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为枯草芽孢杆菌(Baci llus subtilis)，其保藏编号为CGMCC No.11522。所述质粒pHP13L包括以下结构部分：

A.PAs基因表达盒，由噬菌体φ29的A1启动子a1以及枯草芽孢杆菌(B.subtilis)aprE基因的稳定子a2构成；其中所述PAs为该基因表达盒的命名；