[发明专利]对样品中目标核酸序列进行偏向扩增的方法和试剂盒

权利要求书

1.对样品中目标核酸序列进行偏向扩增的方法，所述目标核酸序列相对于其野生型形式具有一处或多处突变，所述方法包括以下步骤：

(1)提供与所述目标核酸序列的野生型形式的至少一部分的正义链和/或反义链互补的单链封闭序列，其中所述封闭序列中包含一处或多处锁核酸置换；

(2)提供包含所述样品、封闭序列和根据所述目标序列设计的正向和反向引物的PCR反应体系并进行循环扩增反应，其中变性步骤包括：

升温至足够高的温度，使所述封闭序列与所述样品中的核酸接触，随后降温至第一温度使所述封闭序列与所述目标核酸序列以及目标序列的野生型形式形成双链体，其中所述第一温度高于所述引物与模板的退火温度，

随后升温至第二温度，所述第二温度比所述封闭序列与所述目标序列的野生型形式形成的双链体的熔解温度(T_m)低1-5℃，并且高于目标序列的野生型形式双链体的T_m；以及

(3)任选地，分离和纯化步骤(2)获得的扩增产物，

其中所述封闭序列包含10％至100％的锁核酸置换，并且置换后的各个锁核酸碱基之间所间隔的未置换碱基的数量最大变异不超过3个。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述目标序列包含40-250个核苷酸。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述封闭序列包含10％至30％的锁核酸置换。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述目标序列包含40-100个核苷酸。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述封闭序列的长度比所述目标序列短20-40个碱基，且所述封闭序列的两端与步骤(2)使用的正向和反向引物分别有3-5个碱基的重叠。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述封闭序列在3’端包含防止所述封闭序列在PCR反应中进行延伸的化学修饰。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述封闭序列在3’端包含磷酸化修饰、C3-间隔子修饰或C6-间隔子修饰。

8.用于对核酸样品中的目标片段进行偏向扩增的试剂盒，所述目标序列相对于其野生型形式具有一处或多处突变，所述试剂盒包含与所述目标序列的野生型形式的至少一部分的正义链和/或反义链互补的单链封闭序列，其中所述封闭序列中包含一处或多处锁核酸置换，其中所述封闭序列包含10％至100％的锁核酸置换，并且置换后的各个锁核酸碱基之间所间隔的未置换碱基的数量最大变异不超过3个。