[发明专利]对样品中目标核酸序列进行偏向扩增的方法和试剂盒

说明书

提供对样品中相对于野生型形式具有突变的目标核酸序列进行偏向扩增的方法，包括：提供与目标核酸序列的野生型形式的至少一部分的正义链和/或反义链互补的单链封闭序列，封闭序列中包含一处或多处锁核酸置换；提供包含样品、封闭序列和根据目标序列设计的正向和反向引物的PCR反应体系并进行循环扩增反应，变性步骤包括：升温至足够高的温度，使封闭序列与样品中的核酸接触，随后降温至第一温度使封闭序列与目标核酸序列以及目标序列的野生型形式形成双链体，第一温度高于引物与模板的退火温度，随后升温至第二温度，第二温度比封闭序列与目标序列的野生型形式形成的双链体的熔解温度(T_m)低约1‑5℃，并且高于目标序列的野生型形式双链体的T_m。

发明领域

本申请涉及分子生物学领域。具体而言，本申请涉及对样品中的目标核酸片段进行偏向扩增的方法、试剂盒、系统及其应用。

发明背景

基因突变，特别是点突变，是生物学领域中生理状态或病理状态下的常见现象。因此，对于基因突变的检测在很多领域中具有重要意义。

目前，对于检测基因突变，公认的金标准是Sanger测序法。但是，该方法要求样品中突变基因的丰度比较高，通常在20％以上才能够进行检测。因此，对于某些低频突变而言，直接应用测序法存在较大困难或难以实现。

因此，基因突变检测方法，特别是对于低频突变的检测方法亟需改进。本申请针对该需求提供了新的用于对核酸样品中的目标片段(特别是样品中的低频突变)进行偏向扩增的方法、试剂盒以及系统，从而为基因突变检测提供了基础。

发明概述

第一方面，本申请提供了用于对核酸样品中的目标片段进行偏向扩增的方法，目标片段相对于其野生型形式具有一处或多处突变，所述方法包括以下步骤：

(1)提供与所述目标核酸序列的野生型形式的至少一部分的正义链和/或反义链互补的单链封闭序列，其中所述封闭序列中包含一处或多处锁核酸置换；

(2)提供包含所述样品、封闭序列和根据所述目标序列设计的正向和反向引物的PCR反应体系并进行循环扩增反应，其中变性步骤包括：

升温至足够高的温度，使所述封闭序列与所述样品中的核酸接触，随后降温至第一温度使所述封闭序列与所述目标核酸序列以及目标序列的野生型形式形成双链体，其中所述第一温度高于所述引物与模板的退火温度，

随后升温至第二温度(即关键变性温度Tc)，所述第二温度比所述封闭序列与所述目标序列的野生型形式形成的双链体的熔解温度(T_m)低约1-5℃，并且高于目标序列的野生型形式双链体的T_m。

在一些实施方案中，方法还包括分离和纯化步骤(2)获得的扩增产物。

在一些实施方案中，目标片段包含约40-250个碱基。

在一些实施方案中，封闭序列包含约10％至约100％的锁核酸置换。

在一些实施方案中，锁核酸置换在封闭序列中为基本上均匀地分布。

在一些实施方案中，封闭序列的长度比目标片段短约20-40个碱基，且封闭序列的两端与步骤(2)使用的正向和反向引物分别有大约3-5个碱基的重叠。

在一些实施方案中，封闭序列在3’端包含防止所述封闭序列在PCR反应中进行延伸的化学修饰，例如磷酸化修饰、C3-间隔子修饰、C6-间隔子修饰。

第二方面，本申请提供了用于对核酸样品中的目标片段进行偏向扩增的试剂盒，目标片段相对于其野生型形式具有一处或多处突变，所述试剂盒包含与目标片段的野生型形式的至少一部分的正义链和/或反义链互补的单链封闭序列，其中封闭序列中包含一处或多处锁核酸置换。

在一些实施方案中，试剂盒还包含根据目标片段设计的正向和反向引物。