[发明专利]一种线粒体tRNAThr 15909A〉G突变检测方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种检测线粒体tRNA^Thr15909A>G突变的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

(1)提取全基因组DNA；

(2)设计特异性引物：根据人类线粒体基因剑桥参考序列(HumanMitochondrialDNARevisedCambridgeReferenceSequence，GenBank登陆号：NC_012920.1)在15909位点前后345bp和183bp处设计上游引物15909F、下游引物15909R；

(3)特异性条带PCR扩增；

(4)专一性限制性内切酶HpyCH4V酶切：所述专一性限制性内切酶HpyCH4V特异性的识别TGCA回文结构，tRNA^Thr15909A>G突变后，产生限制性内切酶HpyCH4V识别的TGCA回文结构，快速酶切；

(5)突变鉴定：将酶切后的产物进行凝胶电泳。

2.根据权利要求1所述的检测线粒体tRNA^Thr15909A>G突变的方法，其特征在于，所述步骤(1)提取全基因组DNA步骤包括针对采样方式、样本来源以及样本形式的不同选择相应的方法进行预处理。

3.根据权利要求2所述的检测线粒体tRNA^Thr15909A>G突变的方法，其特征在于，所述步骤(1)提取全基因组DNA步骤如下：用细胞裂解液和溶液Ⅰ对所述经预处理得到的样本进行消化裂解，再用酚-氯仿-异戊醇沉淀DNA，用乙醇清洗有机溶剂，最后用溶液Ⅱ溶解DNA后于-20℃保存备用。

4.根据权利要求3所述的检测线粒体tRNA^Thr15909A>G突变的方法，其特征在于，所述溶液Ⅰ的主要成分为蛋白酶K，溶液Ⅱ的主要成分为氢氧化钠。

5.根据权利要求1所述的检测线粒体tRNA^Thr15909A>G突变的方法，其特征在于，所述步骤(3)特异性条带PCR扩增循环参数如下：

94℃下预变性5min，循环1次；

94℃下变性30s，Tm下退火45s，72℃下延伸60s，循环35次；

72℃下延伸6min，循环1次；

16℃下10min，循环1次。

6.根据权利要求1所述的检测线粒体tRNA^Thr15909A>G突变的方法，其特征在于，所述步骤(4)专一性限制性内切酶HpyCH4V酶切步骤如下：将步骤(3)获得的特异性条带PCR扩增得到的产物1ug、10Unit限制性内切酶HpyCH4V及2ul10×酶切缓冲液及三蒸水组成20ul体系，37℃加热1h，即可完成酶切。

7.根据权利要求1所述的检测线粒体tRNA^Thr15909A>G突变的方法，其特征在于，步骤(5)所述凝胶电泳为琼脂糖凝胶电泳。

8.根据权利要求1所述的检测线粒体tRNA^Thr15909A>G突变的方法，其特征在于，步骤(5)的结果显示如下：经电泳后，所述携带线粒体tRNA^Thr15909A>G突变样本酶切产物为两条带，而不携带该突变样本的产物为一条带。

9.基于权利要求1—8的任一项所述的检测线粒体tRNA^Thr15909A>G突变的方法制备的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有：

(1)提取样本全基因组DNA所需的试剂，包括权利要求3、4所述的细胞裂解液、溶液Ⅰ、酚-氯仿-异戊醇混合液和溶液Ⅱ；

(2)PCR扩增反应试剂，包括dNTP、10×PCR缓冲液、MgCl₂、上游引物15909F、下游引物15909R、Taq酶和三蒸水；

(3)酶切反应试剂，包括：限制性内切酶HpyCH4V、酶切缓冲液。

10.权利要求1至8的任一项所述的方法或权利要求9所述的试剂盒在检测线粒体tRNA^Thr15909A>G突变的应用。