[发明专利]一种线粒体tRNAThr 15909A〉G突变检测方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于线粒体tRNA突变检测领域，尤其涉及一种线粒体tRNA^Thr15909A>G突变检测方法、试剂盒及其应用。

背景技术

心血管疾病是全球造成死亡的首要原因，据世界卫生组织统计，2008年约有1730万人死于心血管病，到2030年，几乎有2330万人将死于心血管病，而高血压是心血管疾病的首位危险因素。高血压影响全世界超过三分之一的成年人，即大约10亿人，每年造成全世界900多万人死亡，其中半数死于心脏病和中风，高血压还可引起肾衰竭、盲症、血管破裂以及脑损伤。高血压按照发病原因可以分为原发性高血压和继发性高血压，原发性高血压约占所有高血压的90-95％。

线粒体是一种由两层膜包被的细胞器，是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要场所，为细胞的活动提供能量，所以有“细胞动力工厂”之称。除了为细胞供能外，线粒体还参与如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。

线粒体基因是人体内唯一的核外遗传物质。线粒体tRNA基因突变是与原发性高血压相关的突变热点区域，2009年GuanMX等人发现，位于线粒体tRNA^Thr基因4435A>G突变与原发性高血压相关(YuqiLiu,Min-XinGuanetal.Hypertention，2009；53:1083-1090)，2011年又进一步在细胞功能水平证明线粒体tRNA^Thr基因4435A>G可能影响原发性高血压的发生发展(ZhongqiuLu，Min-XinGuanetal.EurJHumGenet，2011；19:1181-1186)。

目前对于线粒体tRNA^Thr15909A>G突变的检测方法为第一代基因测序技术，但此技术对仪器要求高，操作繁琐且成本昂贵，结果误差大、敏感性差并且存在放射性核素污染；近年来，变性高效液相色谱(DHPLC)和基因芯片的应用为线粒体tRNA^Thr15909A>G突变检测提供了思路，检测技术灵敏度和特异度均较高，自动化程度高，适合高通量检测，但涉及仪器昂贵，需专人操作，不适合广泛推广。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种线粒体tRNA^Thr15909A>G突变方法，通过酶切法进行的线粒体tRNA^Thr15909A>G突变检测，克服了现有方法耗时长、操作难、成本高等缺点，提供线粒体tRNA^Thr15909A>G突变检测试剂盒，以及上述方法或上述的试剂盒在检测与线粒体tRNA^Thr15909A>G突变检测突变中的应用。

一种检测线粒体tRNA^Thr15909A>G突变的方法，其包括如下步骤：

(1)提取全基因组DNA；

(2)设计特异性引物：根据人类线粒体基因剑桥参考序列(HumanMitochondrialDNARevisedCambridgeReferenceSequence，GenBank登陆号：NC_012920.1)在15909位点前后345bp和183bp处设计上游引物15909F(序列号：5’-TATTTCCTATTCGCCTAC-3’)、下游引物15909R(序列号：5’-TACATAGCGGTTGTTGAT-3’)；

(3)特异性条带PCR扩增；

(4)专一性限制性内切酶HpyCH4V酶切：所述专一性限制性内切酶HpyCH4V特异性的识别TGCA回文结构，tRNA^Thr15909A>G突变后，产生限制性内切酶HpyCH4V识别的TGCA回文结构，快速酶切；

(5)突变鉴定：将酶切后的产物进行凝胶电泳。

所述步骤(1)提取全基因组DNA步骤包括针对采样方式、样本来源以及样本形式的不同选择相应的方法进行预处理。

所述步骤(1)提取全基因组DNA优选步骤如下：用细胞裂解液和溶液Ⅰ对所述经预处理得到的样本进行消化裂解，再用酚-氯仿-异戊醇沉淀DNA，用乙醇清洗有机溶剂，最后用溶液Ⅱ溶解DNA后于-20℃保存备用。

所述溶液Ⅰ的主要成分为蛋白酶K，溶液Ⅱ的主要成分为氢氧化钠。

所述步骤(3)特异性条带PCR扩增优选循环参数如下：

94℃下预变性5min，循环1次；