[发明专利]一种显示大黄鱼着丝粒和短臂的方法

权利要求书

1.一种显示大黄鱼着丝粒和短臂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)染色体制备

提前20h按每克鱼体重于胸鳍基部注射7.5～8.5mg党参的煎汁液和18～20μg BSA混合液，暂养于24～26℃海水中；提前5h再用同样方法注射同样的试剂；提前2.5h按每克鱼体重于胸鳍基部注射0.4～0.6μg/g的秋水仙素；取头肾细胞，使用0.075M KCl低渗35～45min，卡诺氏固定液固定2～4次，滴片前将卡诺氏固定液换成甲醇/乙酸混合液；在玻片表面呵一层水汽，距玻片1cm处滴加细胞悬浮液，置于空气中自然干燥；

(2)人类基因组DNA提取

用组织基因组DNA提取试剂盒提取人类唾液DNA，在刷牙前，将生理盐水倒入口中，漱口25～35s，吐到废液收集杯，再次将生理盐水倒入口中，用力漱口1min，然后仔细将漱口液吐入一次性口杯中，取1.5ml，室温离心12～18min，离心速度为8000rpm ，倒掉上清液，剩余口腔上皮细胞沉淀；

(3)探针制备

根据人类的28S rDNA序列设计引物：18S-UF-5’-GGCACGAGACCGATAGTCAACA-3’18S-UR-5’-ACCTGCTGCGGATATGGGTAC-3’；

PCR扩增反应体系为20μL：10μM的引物各1μL，人类基因组DNA0.9～1.1μL，10×buffer1.8～2.2μL，2.5mmol/L dNTP混合物1.5～1.7μL，2.5U/μLFastful DNA聚合酶0.18～0.22μL，加双蒸水至20μL；

使用缺口平移试剂盒标记探针，反应体系为20μL：10×buffer 1.8～2.2μL，试剂盒中的酶混合液2.8～3.2μL，dNTP 6.8～7.2μL，Biotin-dUTP 0.28～0.32μL，人类28S rDNA扩增产物0.9～1.1μg，加蒸馏水至20μL，14.5～15.5℃反应85～95min，取1.90～2.10μL缺口平移产物用于1％的琼脂糖凝胶电泳分析；

剩下的探针溶液用4.5～5.5μL 3M醋酸钠、9.5～10.5μL鲑精DNA、98～102μL无水乙醇进行沉淀，54.5～55.5℃开盖干燥后溶于38～42μL杂交缓冲液中，制成探针混合液；

(4)荧光原位杂交

①标本的预处理：将玻片进行老化、蛋白酶K、丙酮处理，然后放入体积分数为78～82％的甲酰胺/2×SSC溶液中，64.5～65.5℃变性2.4～2.6min，并用冰乙醇脱水处理；

②探针变性：将探针混合液在74～76℃的水浴锅中变性7～9min，然后迅速转入冰中迅速冷却10min以上；

③杂交：滴20μL变性的探针混合液于大黄鱼染色体玻片上，盖封口膜，置于湿润暗盒中，36.5～37.5℃孵化12～16h；

④杂交后洗脱：将杂交后的玻片依次用体积分数为9～11％的甲酰胺/2×SSC和4×SSC洗涤；其次，用Avidin-Alexa Fluor488溶液与探针分子在36～38℃、湿润黑暗的环境中特异结合28～32min，依次使用4×SSC-Trixton和4×SSC洗涤；端粒重复序列FISH定位需要经过第二次特异结合，即在玻片上滴加BiotinylatedAnti-Avidin D溶液培育30min后洗脱，再滴加Avidin-Alexa Fluor 488溶液培育30min后再洗脱；最后，在玻片上滴加PI抗褪色剂复染，荧光显微镜观察结果；

⑤信号检测：使用Olympus BX53荧光显微镜完成显微观察与拍照，通过绿色荧光滤片组观察红色荧光信号，通过蓝色荧光滤片组观察绿色荧光信号，利用显微镜相连的DP73电荷藕合器件图像传感器(CCD)拍摄图像，使用cellSens软件分别采用黑白模式采集图像，再组合通道形成彩色图像。

2.根据权利要求1所述的显示大黄鱼着丝粒和短臂的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，甲醇/乙酸的混合液中，甲醇：乙酸的体积比为1.8～2.2:1。

3.根据权利要求1所述的显示大黄鱼着丝粒和短臂的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，PCR扩增反应的条件为：97.5～98.5℃预变性4～6min；97.5～98.5℃变性28～32s，58～62℃退火28～32s，71～73℃延伸3～5min，循环35次；最后71～73℃延伸9～11min，3～5℃保存。